1. Откријте апсорпцију раствора РНК
Апсорбанца на 280, 320, 230 и 260 нм представља вредности нуклеинске киселине, позадине (замућеност раствора), концентрације соли и органске материје као што је протеин, респективно.Генерално гледајте само ОД260/ОД280 (однос, Р).Када је 1,8~2,0, мислимо да се контаминација протеина или друге органске материје у РНК може толерисати, али треба напоменути да када се Трис користи као пуфер за детекцију апсорбанције, Р вредност може бити већа од 2 (углавном би требало да буде <2,2).Када је Р<1,8, загађење протеина или друге органске материје у раствору је очигледније, а судбина РНК се може одредити према потребама.Када је Р>2,2, то значи да је РНК хидролизована у једну нуклеинску киселину.
2.Електрофоретски образац РНК
Генерално, денатурирајући гел се користи за електрофорезу РНК, али ако је само за детекцију квалитета РНК, денатурирајући гел није неопходан, већ се може користити обичан гел агарозе.Сврха електрофорезе је да се открије интегритет 28С и 18С трака и њихов однос, односно интегритет размаза иРНК.Генерално, ако су 28С и 18С траке светле, јасне и оштре (што се односи на ивице трака су јасне), а осветљеност 28С је више него двоструко већа од 18С траке, сматрамо да је квалитет РНК добар.
Горе наведене су две методе које обично користимо, али ниједна од ове две методе нам не може јасно рећи да ли постоји резидуална РНКаза у РНК раствору.Ако се у раствору налази веома мала количина РНазе, тешко нам је да је откријемо горенаведеном методом, али већина наредних ензимских реакција се одвија на изнад 37 степени и дуго времена.На овај начин, ако постоји веома мала количина РНК у раствору РНК, тада ће постојати веома погодно окружење и време да одиграју своју улогу у наредним експериментима, и наравно експеримент ће у овом тренутку бити хладан.У наставку представљамо методу која може потврдити да ли постоји резидуална РНКаза у РНК раствору.
3. Тест очувања топлоте
Према концентрацији узорка, извуците две РНК од 1000 нг из раствора РНК и додајте је у епрувету за центрифугирање од 0,5 мл и допуните је Трис пуфером пХ 7,0 до укупне запремине од 10 ул, а затим затворите поклопац епрувете.Ставите једну од њих у водено купатило са константном температуром на 70°Ц и држите на топлом 1 х.Други део је чуван у фрижидеру на -20°Ц 1 х.Када време истекне, уклоните два узорка за електрофорезу.Након што је електрофореза завршена, упоредите електрофоретске траке ова два.Ако су ове две траке конзистентне или немају значајну разлику (наравно, њихове траке такође испуњавају услове из методе 2), то значи да у раствору РНК нема преостале контаминације РНК, а квалитет РНК је веома добар.Напротив, ако узорак инкубиран на 70°Ц показује очигледну деградацију, то указује да постоји контаминација РНК у раствору РНК.
2 Експерименталне методе и технике за екстракцију РНК
Проблеми са којима се често сусрећемо приликом екстракције РНК су: (1) принос РНК је низак;(2) РНК има озбиљно загађење соли;(3) РНК има озбиљно загађење органским растварачем;(4) деградација узорка и други проблеми
1. Често коришћени реагенси за екстракцију укупне РНК
Метода гванидин изотиоцијаната и метода Тризол су најчешће коришћене методе за екстракцију укупне РНК из животињских ткива и животињских ћелија.Посебно је погодан за мале узорке и ткива која се посебно тешко издвајају, као што је екстракција укупне РНК из коже зеца и животињског везивног ткива;поред тога, Тризол, као реагенс за лизу опште намене, може се користити и за екстракцију биљних ткива, бактерија, гљивица и других ткива.За биљна ткива која садрже полисахариде и полифеноле, као што су камелија олеифера, листови чаја, уљане репице, итд., ЦТАБ метода се такође може користити за екстракцију укупне РНК.
Као конвенционална метода, метода са двоструком колоном је такође веома популарна због нормалног рада на температури, нема потребе за додавањем РНазе и безбедности – нема хлороформа, фенола и других органских реагенаса за екстракцију.(препоручени производи )
2. Екстракција укупне РНК из животињских ткива
(1) Покушајте да изаберете свеже ткиво, ако није свеже (пожељно у року од три месеца - у фрижидеру на 80 ℃ или замрзнуто у течном азоту. Када сечете ткиво, немојте сећи директно на собној температури, обавезно га ставите на кутију за лед, покушајте да избегнете поновљено замрзавање и одмрзавање.
(2) Користите чисте маказе и пинцету да исечете мали комад ткива, покушајте да исечете централни део ткива када сечете узорак, или прво исеците велики комад ткива из средине, а затим исеците узорак на месту свежег реза.Уклоњено ткиво треба потпуно уситнити, ставити исецкано ткиво у ЕП епрувету без РНазе, додати лизат, исецкано ткиво треба у потпуности изложити лизату и припремити за хомогенизацију.
(3) За нормална ткива, изаберите ткива величине зрна мунг пасуља (30-60 мг) за хомогенизацију.Ако ткива садрже велику количину протеина, масти или густог влакнастог ткива као што је јетра, на одговарајући начин повећајте или смањите количину исеченог ткива (опционо) Изаберите 10~20 мг).
(4) Ако се екстрахују мишићи рибе, месо шкампа, медузе и друга ткива са високим садржајем воде, запремину узорка треба на одговарајући начин повећати (препоручено 100-200 мг).
(5) Ако услови дозвољавају, животињско ткиво се може директно екстраховати након хомогенизације високопролазним хомогенизатором ткива, ако не постоји таква опрема.
(6) РНК добијена након коначне екстракције мора се одмах ставити на ледену кутију да би се смањила деградација РНК.
3. Екстракција РНК животињских ћелија
(1) Ћелије за суспензију: центрифугирајте директно и одбаците медијум, исперите стерилним ПБС-ом 1-2 пута, затим суспендујте са одговарајућом количином ПБС-а, а затим додајте лизат за лизу.Немојте додавати лизат директно у преципитиране ћелије након што потпуно одбаците течност.Ово ће довести до тога да се пакет хистона који се ослобађа након лизираних ћелија на спољашњем слоју прилепи на спољашњу страну преципитираних ћелија, чиме се ограничава контакт ћелија унутар пелета са лизатом., што доводи до непотпуне ћелијске лизе и смањеног приноса РНК.
(2) Ћелије које су полу-адхерентне или нису чврсто приањале: Након одбацивања медијума, исперите са ПБС-ом 1-2 пута, а затим директно апсорбујте одговарајућу количину ПБС-а и дувајте посуду за културу пипетом или пиштољем да бисте одували ћелије и пребаците их у ћелије без РНК.Додајте лизат у ЕП епрувету ензима за екстракцију.
(3) Адхерентне ћелије: прво треба да се дигестирају трипсином, затим сакупе у ЕП епрувете без РНазе, центрифугирају да би се уклонио супернатант, испрати 1-2 пута са ПБС-ом да би се уклонио вишак трипсина и ресуспендовати са одговарајућом количином ПБС-а. Затим прећи на корак екстракције.
4. Екстракција РНК биљака
Биљна ткива су богата фенолним једињењима, или су богата полисахаридима, или садрже неке неидентификоване секундарне метаболите, или имају високу активност РНазе.Ове супстанце су чврсто комбиноване са РНК након ћелијске лизе да формирају нерастворљиве комплексе или колоидне талоге, које је тешко уклонити.Стога, када вадимо биљно ткиво, треба да изаберемо комплет за биљке.Лизат у комплету може ефикасно да реши проблеме лаке оксидације полифенола и одвајања полисахаридних једињења и нуклеинских киселина.
(За екстракцију РНК биљака полисахарида полифенола, препоручени производи:
(1) Кору, пулпу, семе, листове итд. биљке треба потпуно самлети у малтеру.Током процеса млевења, течни азот треба допунити на време како би се избегло топљење узорка.Млевени узорак треба брзо додати у лизат и протрести да би се избегла деградација РНК.
(2) За узорке богате влакнима као што су листови пиринча и пшенице, количину екстракције треба на одговарајући начин смањити, иначе млевење ткива и лиза неће бити потпуни, што резултира ниским приносом екстраховане РНК.
(3) За биљна ткива са високим садржајем воде, као што су плод нара, плод лубенице, плод брескве, итд., величину узорка треба повећати на одговарајући начин (100-200 мг је опционо).
(4) Биљним ткивима, као што су листови биљака, ризоми, тврди плодови и други материјали, генерално се препоручује употреба течног азота за темељно малтерисање састојака у малтеру, а затим прећи на корак екстракције.Конвенционални хомогенизатори ткива можда неће бити ефикасни у хомогенизацији биљних ткива и генерално се не препоручују.
5. Мере предострожности за екстракцију РНК
(1) Узорци ткива треба да буду што је могуће свежији како би се избегло поновно замрзавање и одмрзавање.
(2) Ткиво при екстракцији треба потпуно самлети, а количина ткива не сме бити премала, а камоли превелика.
(3) Потребно је дати довољно времена инкубације након додавања лизата да се узорак потпуно лизира.
(4) Када се користи Тризол метода за екстракцију, принцип апсорпције супернатанта након стратификације је „радије удисати мање него удисати више“, и не сме се екстраховати у средњи слој, иначе ће изазвати озбиљну контаминацију геномске ДНК.
(5) Приликом прања, течност за прање треба у потпуности да се инфилтрира око зида цеви да би се обезбедило темељно прање.
(6) За метод екстракције колоне, поред одвајања колоне након прања, адсорпциону колону такође треба ставити у ултра чисту клупу и дувати 5-10 минута да би органски растварач потпуно испарио до сува.
(7) На последњем елуирању методом колоне, након додавања ДЕПЦ воде, треба је инкубирати 3-5 минута, или ДЕПЦ воду треба загрејати на 60°Ц унапред да би се повећао принос елуирања.У традиционалној методи цепања Тризола и преципитације изопропанолом, коначна РНК се раствори у ДЕПЦ води, тако да треба дати одговарајуће време за растварање, а дно епрувете за центрифугирање треба непрекидно дувати врхом пипете.
3 Тхрее Узроци и решења за ниску концентрацију РНК/лош квалитет
1. Принос је пренизак
Екстраховани узорак је пренизак, укупна количина је недовољна или је екстраховани узорак превише и лиза није потпуна;ткиво или ћелије одговарајућег квалитета треба користити за екстракцију, претходна обрада узорка мора бити добро обављена, а лиза треба да буде довољна.
2. Остаци генома
Приликом екстракције Тризол методом, када се супернатант усисава у средњи слој након наношења слојева, доћи ће до озбиљне контаминације генома;треба посветити посебну пажњу приликом наношења слојева како би се избегло усисавање у средњи слој.Ако се метода колоне користи за екстракцију, за екстракцију се може изабрати комплет који садржи ДНазу И.Нуклеинска киселина адсорбована на мембрани се директно вари са ДНазом И, што може у великој мери да смањи остатке ДНК.
3. деградација РНК
То може бити деградација самог екстрахованог узорка или деградација изазвана током процеса екстракције;колико је то могуће, свеже узорке треба користити за екстракцију РНК, а прикупљене узорке треба чувати у течном азоту или фрижидеру на -80°Ц на време, и избегавати поновљено замрзавање и одмрзавање.У процесу екстракције РНК треба користити врхове без РНазе/ДНазе, епрувете за центрифугирање и друге материјале.Процес екстракције треба да буде што је бржи.Екстраховану РНК треба ставити у кутију за лед и чувати на -80 на време.Ако екстраховану РНК треба детектовати гел електрофорезом, електрофорезу треба извршити одмах након екстракције, а пуфер за електрофорезу заменити новоприпремљеним.
4. Остаци соли и органског растварача
Реагенси за екстракцију садрже соли фенола и гванидина, а раствор за прање садржи етанол.Током процеса екстракције, лизат није потпуно апсорбован и одбачен, а раствор за прање није потпуно осушен.Преостале соли и органски растварачи су штетни за накнадну реверзну транскрипцију и ПЦР.Различити степен инхибиције, тако да лизат ткива треба у потпуности да се уклони током процеса екстракције, а испирање треба да буде довољно да се околни зидови епрувете могу опрати.Поред тога, цев се празни и дува је неопходан корак, који ће додатно смањити остатке органске материје.
За више информација о екстракцији РНК, пратите нашу веб страницу:
ввв.фореивд.цом за више информација.
Време поста: 01.12.2022
