Водич за анализу проблема

Следећа анализа проблема на које можете наићиПлант ТоталRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Ротациони стуб је зачепљен

Блокада спин колоне ће узроковати смањење приноса РНК или чак немогућност пречишћавања да би се добила РНК, а квалитет добијене РНК ће бити низак.

Анализа уобичајених узрока:

1. Узорак није потпуно сломљен.

Непотпуна фрагментација узорка може блокирати колону за чишћење ДНК, што такође може утицати на принос и квалитет РНК.Препоручујемо да када вршите фрагментацију узорка, брзо самљете довољне количине течног азота да разбијете ткива као што су ћелијски зидови и ћелијске мембране узорака што је више могуће.За биљне узорке полифенол полисахарида, препоручујемо да користите Плант Тотал РНА Исолатион Кит Плус.

2.Аспирирајте изоловани супернатант из колоне за чишћење ДНК, аспирирајте могући талог ћелијских остатака.

Аспирирана пелета ћелијских остатака може зачепити колону само за РНК током процедура адсорпције РНК (погледајте корак 5 процедуре, корак 6 процедуре полисахаридног полифенола).Препоручујемо да се води рачуна при аспирацији овог супернатанта да се избегне аспирација остатака ћелија.

3. Почетна количина узорка је превелика.

Прекомерна употреба узорка ће довести до непотпуне фрагментације узорка или непотпуне лизе ћелија пуфером ПРЛ1 или пуфером ПСЛ1, што ће резултирати зачепљеном колоном за пречишћавање за операције пречишћавања.Комплет за изолацију укупне РНК биљака има почетни максимум од 50 мг по једном пречишћавању оперисаног узорка.За биљне узорке полифенол полисахарида, препоручујемо да испробате Плант Тотал РНА Исолатион Кит Плус.

4. Температура центрифуге је прениска.

Изолација и пречишћавање целе РНК, осим прекида течног азота ткива узорка, сви кораци се изводе на собној температури (20-25 °Ц).Неке нискотемпературне центрифуге имају температуре испод 20 °Ц, што може да изазове блокаде у колони за чишћење ДНК и/или колони која садржи само РНК.Ако се то догоди, подесите температуру центрифуге на 20-25 °Ц и претходно загрејте смешу за лизу и/или додавање супернатанта за одвајање етанола на 37 °Ц.

РНК се не екстрахује или је принос РНК низак

Обично постоји много фактора који утичу на ефикасност опоравка, као што су: садржај узорка РНК, начин рада, запремина елуирања итд.

Анализа уобичајених узрока као у наставку:

1. У току операције извршено је ледено купатило или центрифугирање на ниској температури (4°Ц).

Препорука: Радите на собној температури (15-25°Ц) током целог процеса, немојте радити ледено купатило и нискотемпературно центрифугирање.

       2.РНК је деградирана због неправилног чувања узорка или дуготрајног чувања узорка.

Препорука: Свеже сакупљене узорке треба брзо замрзнути у течном азоту, а затим чувати на -80°Ц дуже време, избегавати поновно замрзавање и одмрзавање узорака;или одмах потопите узорке у раствор РНК стабилизатора РНАлатер (животињски узорци).

       3.Недовољна фрагментација узорка и лиза доводе до блокаде колоне за пречишћавање.

Предлог: Приликом млевења ткива, уверите се да је ткиво довољно млевено и брзо га пребаците у унапред припремљени пуфер ПСЛ1 (потврдите да је додат тачан однос β-МЕ, погледајте 1. корак процедуре).

4.Елуент је додат погрешно.

Предлог: Уверите се да је ддХ без РНасе₂О се укапа у средину мембране колоне за пречишћавање.

5. Тачна запремина апсолутног етанола није додата у пуфер ПСЛ2 или пуфер ПРВ2.

Предлог: Пратите упутства, додајте тачну количину апсолутног етанола у пуфер ПСЛ2 и пуфер ПРВ2 и добро промешајте пре употребе комплета.

6. Количина узорка ткива је неодговарајућа.

Препорука: Користите 50 мг ткива на 500 μл пуфера ПСЛ1.Коришћење превише ткива ће смањити количину екстраховане РНК, а такође ће бити смањена и чистоћа резултујуће РНК.Препоручујемо да почетна доза узорка не прелази 50 мг по операцији екстракције РНК.

7. Неодговарајућа запремина елуирања или непотпуно елуирање.

Препорука: Запремина елуента колоне за пречишћавање је 50-200 μл;ако ефекат елуирања није задовољавајући, препоручује се да се продужи време на собној температури након додавања претходно загрејаног ддХ без РНазе₂О, на пример 5-10 мин.

8. Колона за пречишћавање има остатак етанола након испирања пуфером ПРВ2.

   Предлог: Ако се празна епрувета центрифугира 1 мин и још увек има етанола који је остао након прања у пуферу ПРВ2, можете повећати време центрифугирања празне епрувете на 2 мин или ставити колону за пречишћавање на собну температуру на 5 мин да бисте у потпуности уклонили преостали етанол.

9. Комплет је погрешно коришћен.

   Предлог: За биљне узорке полифенолних полисахарида, коришћење уобичајених комплета као што је комплет за изолацију укупне РНК биљака можда неће моћи да добије идеалне узорке РНК.Препоручујемо вам да користите Плант Тотал РНА ИсолатионКит Плус, који је посебно дизајниран за узорке биљака полифенолних полисахарида.Комплет специјално развијен за екстракцију РНК из биљних узорака полифенола и полисахарида.

Вредност ОД260/ОД280 је ниска

РНК елуција са ддХ₂О и који се користи за очитавања спектрофотометра резултира ниским вредностима ОД260/ОД280.Препоручујемо коришћење 10 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,5 (уместо ддХ без РНазе₂О за елуирање РНК) да бисте добили релативно тачне вредности ОД260/ОД280, погледајте „Анали за концентрацију РНК и пречишћавање“ на страни 19.

Пречишћена РНК се разграђује

Квалитет пречишћене РНК је повезан са факторима као што су очување узорка, контаминација РНК-азом и манипулација.

Анализа уобичајених узрока:

1. Узорци ткива нису сачувани на време након сакупљања.

    Препорука: Ако се узорци ткива не користе на време након сакупљања, одмах их похраните у течном азоту на ниској температури или их пренесите на -80°Ц за дуготрајно складиштење након брзог замрзавања у течном азоту, или одмах потопите узорке у раствор РНА стабилизатора РНАлатер (животињски узорци).За екстракцију РНК покушајте да користите свеже сакупљене узорке ткива.

2. Поновљено замрзавање и одмрзавање узорака ткива.

   Препорука: Приликом складиштења узорака ткива, најбоље је да их исечете на мале комаде ради очувања, а део извадите када их користите да бисте избегли деградацију РНК узроковану поновљеним замрзавањем и одмрзавање узорака.

3.РНасе се уводи у операциону салу или се не носе рукавице за једнократну употребу, маске итд.

   Предлог: Експерименте екстракције РНК најбоље је изводити у одвојеним РНК операцијама, а пре експеримента треба очистити лабораторијски сто, а током експеримента треба носити рукавице и маске за једнократну употребу како би се у највећој мери избегла деградација РНК узрокована увођењем РНКазе.

4. Реагенс је контаминиран РНазом током употребе.

   Предлог: Замените новом серијом комплета за екстракцију укупне РНК биљака за сродне експерименте.

5. Центрифугалне епрувете и врхови пипете који се користе за манипулацију РНК су контаминирани РНазом.

Предлог: Уверите се да епрувете за центрифугирање, врхови пипета, пипете итд. који се користе за екстракцију РНК не садрже РНКазу.

Упутства за употребу:

Приручник за употребу комплета за изолацију укупне РНК биљака