一、Повећајте осетљивост реакционог система:

1. Изолујте РНК високог квалитета:

Успешна синтеза цДНК долази од висококвалитетне РНК.РНК високог квалитета треба да буде бар пуне дужине и да не садржи инхибиторе реверзне транскриптазе као што су ЕДТА или СДС.Квалитет РНК одређује максималну количину информација о секвенци коју можете преписати у цДНК.Уобичајена метода пречишћавања РНК је метода у једном кораку користећи гванидин изотиоцијанат/кисели фенол.Да би се спречила контаминација РНК у траговима, РНК изолована из узорака богатих РНазом (као што је панкреас) треба да се чува у формалдехиду да би се очувала висококвалитетна РНК, посебно за дуготрајно складиштење.РНК екстрахована из јетре пацова је у основи деградирана након складиштења у води недељу дана, док је РНК екстрахована из слезине пацова остала стабилна након складиштења у води 3 године.Поред тога, транскрипти дужи од 4 кб су осетљивији на деградацију РНазама у траговима него мали транскрипти.Да би се повећала стабилност ускладиштених узорака РНК, РНК се може растворити у дејонизованом формамиду и чувати на -70°Ц.Формамид који се користи за очување РНК мора бити без остатака који разграђују РНК.РНК из панкреаса може се чувати у форамиду најмање годину дана.Када се припремате за употребу РНК, можете користити следећи метод за таложење РНК: додајте НаЦл у 0,2М и 4 пута већу запремину етанола, ставите на собну температуру 3-5 минута и центрифугирајте на 10.000×г 5 минута.

2. Користите РНасеХ-неактивну (РНасеХ-) реверзну транскриптазу:

Инхибитори РНазе се често додају реакцијама реверзне транскрипције да би се повећала дужина и принос синтезе цДНК.Инхибиторе РНазе треба додати током реакције синтезе првог ланца у присуству пуфера и редукционог агенса (као што је ДТТ), јер процес пре синтезе цДНК денатурише инхибитор, чиме се ослобађа везана РНКаза која може да разгради РНК.Инхибитори протеинске РНАзе само спречавају разградњу РНК од стране РНКазе А, Б, Ц, и не спречавају РНазу на кожи, зато пазите да не унесете РНКазу са прстију упркос употреби ових инхибитора.

Реверзна транскриптаза катализује конверзију РНК у цДНК.И М-МЛВ и АМВ имају ендогену активност РНасеХ поред сопствене активности полимеразе.Активност РНасеХ и активност полимеразе се међусобно такмиче за хибридни ланац формиран између РНК шаблона и ДНК прајмера или цДНК продужетка ланца, и разграђују РНК ланац у комплексу РНК:ДНК.РНК шаблон деградиран активношћу РНасеХ не може више да служи као ефикасан супстрат за синтезу цДНК, што смањује принос и дужину синтезе цДНК.Стога би било корисно елиминисати или у великој мери смањити активност РНасеХ реверзне транскриптазе.。

СуперСцрипт Ⅱ реверзна транскриптаза, РНасеХ-ММЛВ реверзна транскриптаза и тхермоСцрипт реверзна транскриптаза, РНасеХ-АМВ, могу добити већу количину и више цДНК пуне дужине него ММЛВ и АМВ.На РТ-ПЦР осетљивост ће утицати количина синтезе цДНК.ТхермоСцрипт је много осетљивији од АМВ-а.Величина РТ-ПЦР производа је ограничена способношћу реверзне транскриптазе да синтетише цДНК, посебно када се клонирају веће цДНК.У поређењу са ММЛВ, СуперСцрипⅡ је значајно повећао принос дугих РТ-ПЦР производа.РНасеХ-реверзна транскриптаза такође има повећану термостабилност, тако да се реакција може изводити на температурама вишим од нормалних 37-42°Ц.Под предложеним условима синтезе, користите олиго(дТ) прајмер и 10 μЦи [α-П]дЦТП.Укупан принос првог ланца је израчунат применом ТЦА методе преципитације.цДНК пуне дужине је анализирана коришћењем изрезаних трака сортираних по величини и пребројаних на алкалном агарозном гелу.

3. Повећајте температуру инкубације за реверзну транскрипцију:

Виша температура инкубације помаже да се отвори секундарна структура РНК, повећавајући принос реакције.За већину РНК шаблона, инкубација РНК и прајмера на 65°Ц без пуфера или соли, праћена брзим хлађењем на леду ће елиминисати већину секундарних структура и омогућити прајмерима да се вежу.Међутим, неки шаблони и даље имају секундарне структуре, чак и након топлотне денатурације.Амплификација ових тешких шаблона се може извести коришћењем ТхермоСцрипт реверзне транскриптазе и стављањем реакције реверзне транскрипције на вишу температуру да би се побољшала амплификација.Више температуре инкубације такође могу повећати специфичност, посебно када се за синтезу цДНК користе генски специфични прајмери ​​(ГСП) (видети Поглавље 3).Ако користите ГСП, уверите се да је Тм прајмера исти као и очекивана температура инкубације.Немојте користити олиго(дТ) и насумичне прајмере изнад 60°Ц.Насумични прајмери ​​захтевају инкубацију на 25°Ц током 10 минута пре него што се повећа на 60°Ц.Поред коришћења више температуре реверзне транскрипције, специфичност се такође може побољшати директним преношењем мешавине РНК/прајмера са температуре денатурације од 65°Ц на температуру инкубације реверзне транскрипције и додавањем претходно загрејане 2× реакционе смеше (цДНК хот-старт синтхесис).Овај приступ помаже у спречавању интермолекуларног упаривања база које се јавља на нижим температурама.Вишеструко пребацивање температуре потребно за РТ-ПЦР може се поједноставити коришћењем термалног циклуса.

Ттх термостабилна полимераза делује као ДНК полимераза у присуству Мг2+ и као РНК полимераза у присуству Мн2+.Може се одржавати топлим на максималној температури од 65°Ц.Међутим, присуство Мн2+ током ПЦР-а смањује верност, што чини Ттх полимеразу мање погодном за амплификацију високе прецизности, као што је клонирање цДНК.Поред тога, Ттх има ниску ефикасност реверзне транскрипције, што смањује осетљивост, а пошто се реверзна транскрипција и ПЦР могу извести са једним ензимом, контролне реакције без реверзне транскрипције не могу се користити за поређење производа амплификације цДНК са контаминирајућом геномском ДНК.Производи амплификације су одвојени.

4. Адитиви који промовишу обрнуту транскрипцију:

Адитиви укључујући глицерол и ДМСО се додају у реакцију синтезе првог ланца, што може смањити стабилност дволанца нуклеинске киселине и одвојити секундарну структуру РНК.Може се додати до 20% глицерола или 10% ДМСО без утицаја на активност СуперСцрипт ИИ или ММЛВ.АМВ такође може толерисати до 20% глицерола без губитка активности.Да би се максимизирала осетљивост РТ-ПЦР у реакцији реверзне транскрипције СуперСцриптⅡ, може се додати 10% глицерола и инкубирати на 45°Ц.Ако се 1/10 производа реакције реверзне транскрипције дода у ПЦР, онда је концентрација глицерола у реакцији амплификације 0,4%, што није довољно да инхибира ПЦР.

5. РНасеХ третман:

Третман реакција синтезе цДНК са РНасеХ пре ПЦР-а може повећати осетљивост.За неке шаблоне, сматра се да РНК у реакцији синтезе цДНК спречава везивање продуката амплификације, у ком случају третман РНасеХ може повећати осетљивост.Генерално, третман РНасеХ је неопходан када се појачавају дужи цДНК циљни шаблони пуне дужине, као што је туберозна сцхероза ИИ са ниским бројем копија.За овај тежак шаблон, третман РНасеХ је побољшао сигнал произведен од стране СуперСцрипт ИИ или АМВ-синтетизоване цДНК.За већину РТ-ПЦР реакција, третман РНасеХ је опциони, јер корак ПЦР денатурације на 95°Ц генерално хидролизује РНК у комплексу РНК:ДНК.

6. Побољшање методе детекције мале РНК:

РТ-ПЦР је посебно изазован када су доступне само мале количине РНК.Гликоген додат као носач током изолације РНК помаже да се повећа принос малих узорака.Гликоген без РНазе се може додати истовремено са додавањем Тризола.Гликоген је растворљив у води и може се држати у воденој фази са РНК да би помогао накнадном таложењу.За узорке мање од 50 мг ткива или 106 култивисаних ћелија, препоручена концентрација гликогена без РНазе је 250 μг/мл.

Додавање ацетилованог БСА у реакцију реверзне транскрипције помоћу СуперСцрипт ИИ може повећати осетљивост, а за мале количине РНК, смањење количине СуперСцрипт ИИ и додавање 40 јединица РНасеОут инхибитора нуклеазе може повећати ниво детекције.Ако се гликоген користи у процесу изолације РНК, и даље се препоручује додавање БСА или инхибитора РНКазе када се користи СуперСцрипт ИИ за реакцију реверзне транскрипције.

二、Повећање РТ-ПЦР специфичности

1. ЦНД Асинтеза:

Синтеза цДНК првог ланца може се покренути коришћењем три различите методе, чија релативна специфичност утиче на количину и тип синтетизоване цДНК.

Метода случајног прајмера била је најмање специфична од три методе.Прајмери ​​се жаре на више места у целом транскрипту, стварајући кратке цДНК делимичне дужине.Овај метод се често користи за добијање 5′ крајњих секвенци и за добијање цДНК из РНК шаблона са регионима секундарне структуре или са терминационим местима која се не могу реплицирати реверзном транскриптазом.Да би се добила најдужа цДНК, однос прајмера и РНК у сваком узорку РНК треба да се одреди емпиријски.Почетна концентрација насумичних прајмера кретала се од 50 до 250 нг по реакцији од 20 μл.Пошто је цДНК синтетизована из укупне РНК коришћењем насумичних прајмера првенствено рибозомална РНК, поли(А)+РНА се генерално бира као шаблон.

Олиго(дТ) прајмери ​​су специфичнији од насумичних прајмера.Хибридизује се са поли(А) репом који се налази на 3′ крају већине еукариотских мРНК.Пошто поли(А)+ РНК чини приближно 1% до 2% укупне РНК, количина и сложеност цДНК је много мања него код насумичних прајмера.Због своје високе специфичности, олиго(дТ) генерално не захтева оптимизацију односа РНК и прајмера и поли(А)+ селекцију.Препоручује се употреба 0,5 μг олиго(дТ) по 20 μл реакционог система.олиго(дТ)12-18 је погодан за већину РТ-ПЦР.ТхермоСцрипт РТ-ПЦР систем нуди олиго(дТ)20 због своје боље термичке стабилности за више температуре инкубације.

Гене специфични прајмери ​​(ГСП) су најспецифичнији прајмери ​​за корак реверзне транскрипције.ГСП је антисенс олигонуклеотид који може специфично да се хибридизује са циљном секвенцом РНК, за разлику од насумичних прајмера или олиго(дТ), који се спајају са свим РНК.Иста правила која се користе за дизајнирање ПЦР прајмера примењују се на дизајн ГСП у реакцијама реверзне транскрипције.ГСП може бити иста секвенца као прајмер за амплификацију који се жари до 3′-краја мРНК, или ГСП може бити дизајниран да се жари низводно од прајмера реверзне амплификације.За неке амплифициране субјекте, више од једног антисенс прајмера мора бити дизајнирано за успешан РТ-ПЦР јер секундарна структура циљне РНК може спречити везивање прајмера.Препоручује се употреба 1 пмол антисенсе ГСП у реакцији синтезе првог ланца од 20 μл.

2. Повећајте температуру инкубације за реверзну транскрипцију:

Да би се у потпуности искористиле предности ГСП специфичности, треба користити реверзну транскриптазу са већом термостабилношћу.Термостабилне реверзне транскриптазе се могу инкубирати на вишим температурама да би се повећала строгост реакције.На пример, ако се ГСП жари на 55°Ц, специфичност ГСП-а неће бити у потпуности искоришћена ако се АМВ или М-МЛВ користи за реверзну транскрипцију при ниској строгости од 37°Ц.Међутим, СуперСцрипт ИИ и ТхермоСцрипт могу да реагују на 50°Ц или више, што ће елиминисати неспецифичне производе који настају на нижим температурама.За максималну специфичност, мешавина РНК/прајмера може се директно пренети са температуре денатурације од 65°Ц на температуру инкубације реверзне транскрипције и додати у претходно загрејану 2× реакциону мешавину (врући почетак синтезе цДНК).Ово помаже у спречавању интермолекуларног упаривања база на ниским температурама.Вишеструки температурни прелази потребни за РТ-ПЦР могу се поједноставити коришћењем термалног циклуса.

3. Смањује контаминацију геномске ДНК:

Потенцијална потешкоћа са РТ-ПЦР-ом је контаминација геномске ДНК у РНК.Коришћењем добре методе изолације РНК, као што је Тризол реагенс, смањиће се количина геномске ДНК која контаминира РНК препарат.Да би се избегли производи изведени из геномске ДНК, РНК се може третирати са ДНазом И степена амплификације да би се уклонила контаминирајућа ДНК пре реверзне транскрипције.Варење ДНазе И је прекинуто инкубацијом узорака у 2,0 мМ ЕДТА током 10 минута на 65°Ц.ЕДТА може да хелатира јоне магнезијума, спречавајући хидролизу РНК зависну од јона магнезијума на високим температурама.

Да би се одвојила амплификована цДНК од контаминирајућих продуката амплификације геномске ДНК, прајмери ​​се могу дизајнирати тако да се сваки жари за одвајање ексона.ПЦР производи изведени из цДНК биће краћи од оних добијених од контаминиране геномске ДНК.Поред тога, изведен је контролни експеримент без реверзне транскрипције на сваком РНК шаблону да би се утврдило да ли је дати фрагмент изведен из геномске ДНК или цДНК.ПЦР производ добијен без реверзне транскрипције је изведен из генома.