• ПЦР је метода која се користи за амплификацију ДНК из мале количине ДНК шаблона.РТ-ПЦР користи реверзну транскрипцију за производњу ДНК шаблона из РНК извора који се затим може појачати.
• ПЦР и РТ-ПЦР су типично реакције крајње тачке, док кПЦР и РТ-кПЦР користе кинетику брзине синтезе производа током ПЦР реакције да квантификују количину присутног шаблона.
• Новије методе, као што је дигитални ПЦР, обезбеђују апсолутну квантификацију почетног ДНК шаблона, док методе као што је изотермни ПЦР смањују потребу за скупом опремом за обезбеђивање поузданих резултата.

Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је релативно једноставна и широко коришћена техника молекуларне биологије за амплификацију и детекцију ДНК и РНК секвенци.У поређењу са традиционалним методама клонирања и амплификације ДНК, које често могу да потрају данима, ПЦР захтева само неколико сати.ПЦР је веома осетљив и захтева минималан шаблон за детекцију и амплификацију специфичних секвенци.Основне ПЦР методе су даље напредовале од једноставне детекције ДНК и РНК.У наставку смо дали преглед различитих ПЦР метода и реагенса које нудимо у Ензо Лифе Сциенцес за ваше потребе истраживања.Циљ нам је да помогнемо научницима да брзо приступе ПЦР реагенсима за употребу у свом следећем истраживачком пројекту!

ПЦР

За стандардни ПЦР, све што вам је потребно је ДНК полимераза, магнезијум, нуклеотиди, прајмери, ДНК шаблон који треба да се амплифицира и термоциклер.ПЦР механизам је једноставан као и његова сврха: 1) дволанчана ДНК (дсДНК) је топлотно денатурисана, 2) прајмери ​​су поравнати са појединачним ланцима ДНК, и 3) прајмери ​​су продужени помоћу ДНК полимеразе, што резултира две копије оригинални ДНК ланац.Процес денатурације, жарења и елонгације током низа температура и времена познат је као један циклус амплификације (слика 1).

Сваки корак циклуса треба оптимизовати за коришћени шаблон и сет прајмера.Овај циклус се понавља приближно 20-40 пута, а амплификовани производ се затим може анализирати, обично помоћу агарозног гела (слика 2).

Пошто је ПЦР веома осетљива метода и за појединачне реакције су потребне веома мале запремине, препоручује се припрема мастер мешавине за неколико реакција.Главна мешавина мора бити добро измешана, а затим подељена по броју реакција, обезбеђујући да свака реакција садржи исту количину ензима, дНТП-а и прајмера.Многи добављачи, као што је Ензо Лифе Сциенцес, такође нуде ПЦР мешавине које већ садрже све осим прајмера и ДНК шаблона.

Региони богати гванином/цитозином (богати ГЦ) представљају изазов у ​​стандардним ПЦР техникама.Секвенце богате ГЦ су стабилније од секвенци са нижим садржајем ГЦ.Штавише, секвенце богате ГЦ имају тенденцију да формирају секундарне структуре, као што су укоснице.Као резултат тога, двоструке ланчиће богате ГЦ тешко је потпуно раздвојити током фазе денатурације.Сходно томе, ДНК полимераза не може без сметњи синтетизовати нови ланац.Виша температура денатурације то може побољшати, а прилагођавања ка вишој температури жарења и краћем времену жарења могу спречити неспецифично везивање прајмера богатих ГЦ.Додатни реагенси могу побољшати амплификацију секвенци богатих ГЦ.ДМСО, глицерол и бетаин помажу да се поремете секундарне структуре које су узроковане ГЦ интеракцијама и на тај начин олакшавају раздвајање двоструких ланаца.

Хот Старт ПЦР

Неспецифична амплификација је проблем који се може појавити током ПЦР-а.Већина ДНК полимераза које се користе за ПЦР најбоље раде на температурама од око 68°Ц до 72°Ц.Ензим, међутим, може бити активан и на нижим температурама, али у нижем степену.На температурама далеко испод температуре жарења, прајмери ​​се могу неспецифично везати и довести до неспецифичне амплификације, чак и ако је реакција постављена на леду.Ово се може спречити употребом инхибитора полимеразе који се одвајају од ДНК полимеразе тек када се постигне одређена температура, отуда и термин ПЦР са врућим стартом.Инхибитор може бити антитело које везује полимеразу и денатурира на почетној температури денатурације (обично 95°Ц).

Полимераза високе верности

Док се ДНК полимеразе умножавају прилично прецизно до оригиналне шаблонске секвенце, може доћи до грешака у подударању нуклеотида.Неподударности у апликацијама као што је клонирање могу довести до скраћених транскрипата и погрешно преведених или неактивних протеина низводно.Да би се избегле ове неусклађености, идентификоване су полимеразе са активношћу „лекторисања“ и укључене у ток посла.Прва полимераза за лектуру, Пфу, идентификована је 1991. у Пироцоццус фуриосус.Овај ензим Пфу има активност егзонуклеазе од 3' до 5'.Како се ДНК појачава, егзонуклеаза уклања неусклађене нуклеотиде на 3' крају ланца.Тада се замењује тачан нуклеотид, а синтеза ДНК се наставља.Идентификација нетачних нуклеотидних секвенци заснива се на афинитету везивања за исправан нуклеозид трифосфат са ензимом, при чему неефикасно везивање успорава синтезу и омогућава исправну замену.Активност коректуре Пфу полимеразе доводи до мањег броја грешака у коначној секвенци у поређењу са Так ДНК полимеразом.Последњих година идентификовани су и други ензими за лектуру, а направљене су и модификације оригиналног ензима Пфу да би се даље смањила стопа грешака током амплификације ДНК.

РТ-ПЦР

ПЦР реверзне транскрипције, или РТ-ПЦР, дозвољава употребу РНК као шаблона.Додатни корак омогућава детекцију и амплификацију РНК.РНК се реверзно транскрибује у комплементарну ДНК (цДНК), користећи реверзну транскриптазу.Квалитет и чистоћа РНК шаблона су од суштинског значаја за успех РТ-ПЦР.Први корак РТ-ПЦР је синтеза ДНК/РНА хибрида.Реверзна транскриптаза такође има функцију РНазе Х, која разграђује РНК део хибрида.Једноланчани ДНК молекул се затим довршава активношћу ДНК-зависне ДНК полимеразе реверзне транскриптазе у цДНК.Ефикасност реакције првог ланца може утицати на процес амплификације.Од сада, стандардна ПЦР процедура се користи за амплификацију цДНК.Могућност да се РНК врати у цДНК помоћу РТ-ПЦР има много предности и првенствено се користи за анализу генске експресије.РНК је једноланчана и веома нестабилна, што чини изазов за рад са њом.Обично служи као први корак у кПЦР, који квантификује РНК транскрипте у биолошком узорку.

кПЦР и РТ-кПЦР

Квантитативни ПЦР (кПЦР) се користи за откривање, карактеризацију и квантификацију нуклеинских киселина за бројне примене.У РТ-кПЦР, РНК транскрипти се често квантификују тако што се прво реверзно транскрибују у цДНК, као што је горе описано, а затим се затим спроводи кПЦР.Као иу стандардном ПЦР-у, ДНК се умножава у три корака који се понављају: денатурација, жарење и елонгација.Међутим, у кПЦР-у, флуоресцентно обележавање омогућава прикупљање података како ПЦР напредује.Ова техника има многе предности због низа доступних метода и хемија.

У кПЦР базираној на боји (обично зелено), флуоресцентно обележавање омогућава квантификацију амплификованих молекула ДНК коришћењем боје која се везује за дсДНК.Током сваког циклуса, мери се флуоресценција.Сигнал флуоресценције се повећава пропорционално количини реплициране ДНК.Дакле, ДНК се квантификује у „реалном времену“ (слика 3).Недостаци кПЦР-а заснованог на боји су то што се само једна мета може истовремено испитати и што ће се боја везати за било коју дс-ДНК присутну у узорку.

У кПЦР базираној на сонди, многе мете се могу детектовати истовремено у сваком узорку, али то захтева оптимизацију и дизајн сонде специфичне за мету која се користи поред прајмера.Доступно је неколико типова дизајна сонде, али најчешћи тип је сонда за хидролизу, која укључује флуорофор и гаситељ.Пренос енергије флуоресцентне резонанце (ФРЕТ) спречава емисију флуорофора преко гаситеља док је сонда нетакнута.Међутим, током ПЦР реакције, сонда се хидролизује током продужетка прајмера и амплификације специфичне секвенце за коју је везана.Цепање сонде одваја флуорофор од гаситеља и резултира повећањем флуоресценције зависно од амплификације (слика 4).Дакле, сигнал флуоресценције из кПЦР реакције засноване на сонди је пропорционалан количини циљне секвенце сонде присутне у узорку.Пошто је кПЦР заснован на сонди специфичнији од кПЦР заснованог на боји, то је често технологија која се користи у дијагностичким тестовима заснованим на кПЦР.

Исотхермал Амплифицатион

Горе поменуте ПЦР технике захтевају скупу опрему за термоциклирање за прецизно повећање и смањење температуре у комори за кораке денатурације, жарења и проширења.Развијене су бројне технике којима нису потребни тако прецизни уређаји и могу се изводити у једноставном воденом купатилу или чак унутар ћелија од интереса.Ове технике се заједнички називају изотермно појачање и раде на бази експоненцијалног, линеарног или каскадног појачања.

Најпознатији тип изотермног појачања је изотермно појачање посредовано петљом или ЛАМП.ЛАМП користи експоненцијално појачање на 65⁰Ц за амплификацију ДНК или РНК шаблона.Када се изводи ЛАМП, четири до шест прајмера који су комплементарни регионима циљне ДНК се користе са ДНК полимеразом за синтезу нове ДНК.Два од ових прајмера имају комплементарне секвенце које препознају секвенце у другим прајмерима и везују их, омогућавајући формирање структуре „петље“ у новосинтетизованој ДНК која затим помаже жарење прајмера у наредним круговима амплификације.ЛАМП се може визуелизовати вишеструким методама, укључујући флуоресценцију, електрофорезу у агарозном гелу или колориметрију.Лакоћа визуелизације и откривања присуства или одсуства производа колориметријом и недостатак потребне скупе опреме учинили су ЛАМП погодном опцијом за тестирање САРС-ЦоВ-2 у областима где клиничко лабораторијско тестирање није било лако доступно, или складиштење и транспорт узорака није било изводљиво, или у лабораторијама које раније нису имале опрему за ПЦР термоциклирање.