У раној фази избијања, због брзог развоја, брза дијагноза сумњивих пацијената је кључ за превенцију ЦОВИД-19.Неки одобрени реагенси за детекцију нуклеинске киселине имају кратко време развоја, а постоје проблеми као што су журна потврда перформанси, недовољна оптимизација реагенса и велике разлике између серија;Проблеми различитих клиничких лабораторија у различитим аспектима процеса детекције нуклеинских киселина такође могу утицати на тачност резултата детекције нуклеинских киселина.Овај чланак ће се фокусирати на кључне везе и тачке у тренутној детекцији нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 и анализирати проблеме лажно негативног и позитивног поновног испитивања лабораторијске детекције нуклеинске киселине и клиничке недоследности.

Принципи детекције САРС-ЦоВ-2 нуклеинске киселине

САРС-ЦоВ-2 је РНК вирус са секвенцом генома од око 29 кб, са 10 гена, који могу ефикасно да кодирају 10 протеина.Вируси се састоје од РНК и протеина, а најудаљенији слој је спољашњи омотач који се састоји од липида и гликопротеина.Унутра, протеински капсид обавија РНК у себи, штитећи тако лако разградљиву РНК (П1).

П1 Структура САРС-ЦОВ-2

Вируси продиру у ћелије преко специфичних рецептора на површини ћелије да изазову инфекцију и користе ћелије домаћина за репликацију.

Принцип откривања вирусне нуклеинске киселине је да се вирусна РНК изложи кроз ћелијски лизат, а затим да се за детекцију користи флуоресцентна реверзна транскрипција-полимераза ланчана реакција у реалном времену (РТ-ПЦР).

Кључ принципа детекције је коришћење прајмера и сонди за постизање „циљаног подударања“ секвенци нуклеинских киселина, односно проналажење секвенце нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 која се разликује од других вируса у око 30.000 база (сличност нуклеинске киселине са другим вирусима), „ниска“ област), дизајн прајмера и сонди.

Прајмери ​​и сонде се у великој мери подударају са специфичним регионом нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2, односно специфичност је веома јака.Када је резултат флуоресцентне РТ-ПЦР амплификације у реалном времену за узорак који се тестира позитиван, то доказује да је САРС-ЦоВ-2 присутан у узорку.Види П2.

П2 Кораци одређивања нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 (флуоресцентна РТ-ПЦР у реалном времену)

Услови и захтеви лабораторије за детекцију нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2

Лабораторије за тестирање нуклеинске киселине су најидеалније за окружења са негативним притиском и треба да обрате пажњу на праћење притиска, одржавају проток ваздуха и елиминишу аеросоле.Особље за тестирање нуклеинске киселине мора имати одговарајуће квалификације, проћи одговарајућу обуку за ланчану реакцију полимеразе и проћи процену.Лабораторијом треба строго управљати, зонирати на месту, а нерелевантном особљу је строго забрањен улазак.Чисто место треба проветравати и дезинфиковати на месту.Релевантни предмети се постављају у зоне, чисте и прљаве се одвајају, замењују на време и деконтаминирају на месту.Рутинска дезинфекција: Дезинфекционо средство које садржи хлор је главно решење за веће површине, а за мале површине се може користити 75% алкохола.Добар начин да се носите са аеросолима је отварање прозора ради вентилације, а дезинфекција ваздуха се такође може обавити ултраљубичастим зрацима, филтрацијом и дезинфекцијом ваздуха.

Кључне везе и параметри одређивања САРС-ЦоВ-2 нуклеинске киселине (флуоресцентна РТ-ПЦР у реалном времену)

Иако лабораторије генерално обраћају велику пажњу на „детекцију нуклеинске киселине“, у ствари, „екстракција“ нуклеинске киселине је такође један од кључних корака за успешно откривање, што је уско повезано са прикупљањем и складиштењем узорака вируса.

Тренутно, најчешће коришћени респираторни узорци, као што су назофарингеални брисеви, користе другу методу, а то је раствор за инактивацију (конзервацију) припремљен на основу екстракције нуклеинске киселине и раствора за лизу.С једне стране, ово решење за очување вируса може денатурисати протеин вируса, изгубити његову активност и више није заразно, и побољшати безбедност у фази транспорта и детекције;с друге стране, може директно да разбије вирус да би ослободио нуклеинску киселину, елиминисао ензим за разлагање нуклеинске киселине и спречио вирус.РНК се разграђује.

Раствор за узорковање вируса припремљен на бази раствора за лизу екстракције нуклеинске киселине.Главне компоненте су избалансиране соли, агенс за хелатирање етилендиаминтетрасирћетне киселине, со гванидина (гванидин изотиоцијанат, гванидин хидрохлорид, итд.), ањонски сурфактант (додекан) натријум сулфат), катјонски сурфактант (тетрадецил триметил амонијум-оксалат), и неколико других фенол-хидол-хидол-оксалатних протеина, фенол-хидро-хидро-кинолокси или више компоненти.Тренутно постоји много врста комплета за екстракцију нуклеинске киселине, а користе се различити реагенси за екстракцију и пречишћавање нуклеинске киселине.Чак и ако се користи исти реагенс за екстракцију и пречишћавање нуклеинске киселине, поступци екстракције сваког комплета су различити.

Тренутно, производи комплета за откривање нуклеинске киселине које је одобрила Национална администрација за медицинске производе бирају се на основу гена ОРФ1аб, Е и Н у геному САРС-ЦоВ-2.Принципи детекције различитих производа су у основи исти, али се њихови прајмери ​​и дизајн сонде разликују.Постоје сегменти са једном метом (ОРФ1аб), сегменти са двоструком метом (ОРФ1аб, Н или Е) и сегменти са три циља (ОРФ1аб, Н и Е).Разлика између детекције и интерпретације, екстракције нуклеинске киселине и флуоресцентног РТ-ПЦР реакционог система у реалном времену треба да се односи на релевантна упутства за комплет, а препоручује се да корисници стриктно прате метод тумачења који је наведен у упутствима комплета за тумачење.Уобичајени региони, прајмери ​​и секвенце сонде амплификоване флуоресцентном РТ-ПЦР у реалном времену приказане су у П3.

П3 Локација циља САРС-ЦоВ-2 ампликона на геному и секвенца прајмера и сонди

Тумачење резултата одређивања нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 (Rеал-Tиме флуоресцентна РТ-ПЦР)

„План превенције и контроле пнеумоније за инфекцију САРС-ЦоВ-2 (друго издање)“ је по први пут разјаснио критеријуме за процену резултата амплификације једног гена:

1. Ниједан Цт или Цт≥40 није негативан;

2. Цт<37 је позитиван;

3. Вредност Цт од 37-40 је област сиве скале.Препоручљиво је поновити експеримент.Ако резултат поновног извођења Цт<40 и крива амплификације имају очигледне врхове, узорак се оцењује као позитиван, у супротном је негативан."

Треће издање водича и четврто издање водича наставили су горе наведене критеријуме.Међутим, због различитих мета које се користе у комерцијалним комплетима, горе поменуто 3. издање водича није дало критеријуме за одређивање комбинације мета, наглашавајући да ће преовладавати упутства произвођача.Почевши од петог издања смерница, две мете су појашњене, посебно критеријуми за процену једне мете о којој је тешко проценити.Односно, ако лабораторија жели да потврди да је случај позитиван на детекцију нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2, потребно је испунити следеће 1 од 2 услова:

(1) Две мете САРС-ЦоВ-2 (ОРФ1аб, Н) у истом узорку су позитивне флуоресцентном РТ-ПЦР у реалном времену.Ако је један циљ позитиван, потребно је поновно узорковање и поновно тестирање.Ако су резултати теста Ако је појединачна мета и даље позитивна, оцењује се као позитивна.

(2) Два узорка флуоресцентног РТ-ПЦР-а у реалном времену показала су једну мету позитивну у исто време или два узорка истог типа показала су један циљ позитиван резултат теста, који се може оценити као позитиван.Међутим, смернице такође наглашавају да негативни резултати тестирања нуклеинске киселине не могу искључити инфекцију САРС-ЦоВ-2.Треба искључити факторе који могу изазвати лажне негативне резултате, укључујући лош квалитет узорка (респираторни узорци из орофаринкса и других делова), узимање узорака прерано или прекасно, Узорци нису правилно ускладиштени, транспортовани и обрађени, а сама технологија је имала проблема (варијација вируса, ПЦР инхибиција) итд.

Узроци лажних негативних резултата у откривању САРС-ЦоВ-2

Концепт „лажно негативног” у тестирању нуклеинске киселине који је тренутно у питању, често се односи на „лажно негативне” у којима резултати теста нуклеинске киселине нису у складу са клиничким манифестацијама, то јест, клинички симптоми и резултати сликања су веома сумњиви на ЦОВИД-19, али тестови нуклеинске киселине су увек „негативни” много пута.Клинички лабораторијски центар Националне здравствене комисије објаснио је „лажно негативан“ тест САРС-ЦоВ-2.

(1) У ћелијама заражене особе постоји одређена количина вируса.Постојећи подаци показују да након заразе организма вирусом вирус улази у грло кроз нос и уста, затим у трахеју и бронхије, а затим доспева у алвеоле.Заражена особа ће доживети период инкубације, благе симптоме, а затим процес тешких симптома и различите стадијуме болести.А количина вируса присутна у различитим деловима тела је различита.

У погледу вирусног оптерећења типова ћелија, алвеоларне епителне ћелије (доњи респираторни тракт)> епителне ћелије дисајних путева (горњи респираторни тракт)> фибробласти, ендотелне ћелије и макрофаги, итд.;из типа узорка, течност за алвеоларну лаважу (најодличнија)>спутум за дубоки кашаљ>брис назофаринкса>брис орофаринкса>крв.Поред тога, вирус се такође може открити у фецесу.Међутим, с обзиром на погодност операције и прихватање пацијената, уобичајени клинички редослед узорка је брис орофаринкса>брис назофаринкса>течност за испирање бронха (комплексна операција) и дубоки спутум (обично сув кашаљ, тешко се добија).

Због тога је количина вируса у ћелијама орофаринкса или назофаринкса код неких пацијената мала или изузетно ниска.Ако се за тестирање узимају само узорци орофаринкса или назофаринкса, вирусна нуклеинска киселина неће бити откривена.

(2) Током сакупљања узорка нису сакупљене ћелије које садрже вирус, или вирусна нуклеинска киселина није ефикасно очувана.

[① Неодговарајуће место за сакупљање, на пример, када се узимају орофарингеални брисеви, дубина сакупљања није довољна, сакупљени брисеви назофаринкса се не сакупљају дубоко у носној шупљини, итд. Већина сакупљених ћелија могу бити ћелије без вируса;

② Брисови за узорковање се користе погрешно.На пример, синтетичка влакна као што су ПЕ влакна, полиестерска влакна и полипропиленска влакна се препоручују за материјал главе штапића.Природна влакна као што је памук се користе у стварном раду (снажна адсорпција протеина и није лако испрати) и најлонска влакна (лоша апсорпција воде, што доводи до недовољне запремине узорковања);

③Неправилна употреба епрувета за складиштење вируса, као што је злоупотреба полипропиленских или полиетиленских пластичних епрувета за складиштење које лако апсорбују нуклеинске киселине (ДНК/РНА), што доводи до смањења концентрације нуклеинске киселине у раствору за складиштење.У пракси се препоручује употреба полиетилен-пропилен полимер пластике и неких посебно обрађених полипропиленских пластичних контејнера за складиштење вирусних нуклеинских киселина.]

[① Неодговарајуће место за сакупљање, на пример, када се узимају орофарингеални брисеви, дубина сакупљања није довољна, сакупљени брисеви назофаринкса се не сакупљају дубоко у носној шупљини, итд. Већина сакупљених ћелија могу бити ћелије без вируса;

② Брисови за узорковање се користе погрешно.На пример, синтетичка влакна као што су ПЕ влакна, полиестерска влакна и полипропиленска влакна се препоручују за материјал главе штапића.Природна влакна као што је памук се користе у стварном раду (снажна адсорпција протеина и није лако испрати) и најлонска влакна (лоша апсорпција воде, што доводи до недовољне запремине узорковања);

③Неправилна употреба епрувета за складиштење вируса, као што је злоупотреба полипропиленских или полиетиленских пластичних епрувета за складиштење које лако апсорбују нуклеинске киселине (ДНК/РНА), што доводи до смањења концентрације нуклеинске киселине у раствору за складиштење.У пракси се препоручује употреба полиетилен-пропилен полимер пластике и неких посебно обрађених полипропиленских пластичних контејнера за складиштење вирусних нуклеинских киселина.]

(4) Рад клиничке лабораторије није стандардизован.Услови транспорта и складиштења узорака, стандардизован рад клиничких лабораторија, тумачење резултата и контрола квалитета су кључни фактори за обезбеђивање тачности и поузданости резултата испитивања.Према резултатима екстерне евалуације квалитета коју је Клиничко-лабораторијски центар Националне здравствене комисије спровео од 16. до 24. марта 2020. године, од 844 лабораторије које су добиле валидне резултате, 701 (83,1%) је квалификовано, а 143 (16,9%) није.Квалификовани, укупни услови лабораторијског тестирања су добри, али различите лабораторије и даље имају разлике у способности рада особља, способности интерпретације позитивног узорка на једној мети и контроли квалитета.

Како смањити лажно негативну детекцију САРС-ЦоВ-2 нуклеинске киселине?

Смањење лажних негативних резултата у детекцији нуклеинске киселине требало би да буде оптимизовано са четири аспекта стварања лажних негативних резултата.

(1) У ћелијама заражене особе постоји одређена количина вируса.Концентрација вируса у различитим деловима тела осумњичених заражених биће различита у различито време.Ако нема ждрела, може бити у течности за испирање бронха или фецесу.Ако се више врста узорака може прикупити у исто време или у различитим фазама прогресије болести за тестирање, помоћи ће да се избегну лажно негативни резултати.

(2) Ћелије које садрже вирус треба да се сакупе током узимања узорака.Овај проблем се у великој мери може решити јачањем обуке сакупљача узорака.

(3) Поуздани ИВД реагенси.Спровођењем истраживања о процени перформанси детекције реагенса на националном нивоу и дискусијом о постојећим проблемима, ефикасност детекције реагенса може се додатно побољшати и осетљивост анализе.

(4) Стандардизован рад клиничких лабораторија.Јачањем обучености лабораторијског особља, континуираним унапређењем система управљања квалитетом лабораторије, обезбеђивањем разумних подела и унапређењем способности особља да детектује, могуће је смањити лажне негативне резултате због неправилног рада лабораторије.

Разлози за поновни позитиван тест нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 код опорављених и отпуштених пацијената

„План дијагнозе и лечења ЦОВИД-19 (пробно седмо издање)“ јасно прописује да је један од критеријума за излечење и отпуштање пацијената са ЦОВИД-19 из болнице да два узастопна узорка респираторног тракта имају негативан тест нуклеинске киселине (размак од најмање 24 сата), али је врло мало. Разлог је био веома мали.

(1) САРС-ЦоВ-2 је нови вирус.Неопходно је даље разумети његов патогени механизам, пуну слику изазване болести и карактеристике тока болести.Због тога је, с једне стране, потребно појачати управљање отпуштеним пацијентима и спроводити 14-дневно медицинско посматрање.Спровести праћење, праћење здравља и здравствено усмеравање ради продубљивања разумевања целокупног процеса настанка, развоја и исхода болести.

(2) Пацијент може поново бити заражен вирусом.Академик Зхонг Нансхан је рекао: Пошто излечени пацијенти имају антитела, САРС-ЦоВ-2 се може елиминисати антителима када поново нападну.Постоји много разлога, који могу бити узрок опорављеног пацијента, или могу бити повезани са мутацијом вируса, или чак узроком лабораторијског испитивања.Ако је у питању сам вирус, мутација САРС-ЦоВ-2 може довести до тога да антитело које производи опорављени пацијент буде неефикасно против мутираног вируса.Ако је пацијент поново заражен мутираним вирусом, тест нуклеинске киселине може поново бити позитиван.

(3) Што се тиче лабораторијских метода испитивања, свака метода испитивања има своја ограничења.Детекција нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 је због избора секвенце гена, састава реагенса, осетљивости методе и других разлога, што доводи до тога да постојећи комплети имају своје доње границе детекције.Након што се пацијент лечи, вирус у телу се смањује.Када је вирусно оптерећење у узорку који се тестира испод доње границе детекције, појавиће се „негативан“ резултат.Међутим, овај резултат не значи да је вирус у телу потпуно нестао.Вирус може бити након прекида лечења.Ресургенце”, наставите да копирате.Због тога се препоручује преглед једном недељно у року од 2 до 4 недеље након отпуштања.

(4) Нуклеинска киселина је генетски материјал вируса.Вирус се убија након што је пацијент подвргнут антивирусном третману, али преостали фрагменти вирусне РНК се и даље задржавају у људском телу и нису у потпуности избачени из тела.Понекад, под одређеним околностима, може се више задржати.Дуго времена и у овом тренутку тест нуклеинске киселине ће бити „пролазно“ позитиван.Са продужењем времена опоравка пацијента, након што се преостали фрагменти РНК у телу постепено исцрпе, резултат теста нуклеинске киселине може постати негативан.

(5) Резултат теста нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 само доказује присуство или одсуство вирусне РНК, а не може доказати активност вируса и да ли је вирус преносив.Неопходно је доказати да ли ће пацијент који поново има позитиван тест нуклеинске киселине поново постати извор инфекције.Неопходно је извршити културу вируса на клиничким узорцима и култивисати „живи“ вирус да би се доказало да је заразан.

Резиме

Укратко, тестови САРС-ЦоВ-2 нуклеинске киселине лажно негативни, поновни позитивни резултати и друга стања која нису у складу са клиничким манифестацијама не могу се у потпуности избећи.У стварном скринингу и тестирању, препоручује се комбиновање клиничких симптома, прегледа имиџинга (ЦТ) и експеримената. Лабораторијски тестови (тест нуклеинске киселине + тест антитела специфичних за вирус) ради свеобухватне дијагнозе како би се спречила промашена дијагноза и погрешна дијагноза.Ако се утврди да резултати теста очигледно нису у складу са клиничким манифестацијама, препоручује се да се спроведе свеобухватна анализа целе тест везе (везе за прикупљање узорака, циркулацију и обраду) како би се искључила могућа рана инфекција вирусом САРС-ЦоВ-2, рекурентна инфекција или комбинована са другим респираторним вирусним инфекцијама итд.Ако услови дозвољавају, препоручује се сакупљање осетљивијих узорака као што су спутум или течност за испирање алвеола за поновно испитивање.

Сродни производи:

Комплет за детекцију нуклеинске киселине САРС-ЦоВ-2 (метод вишеструке ПЦР флуоресцентне сонде)