Верификација перформанси прајмера и сонди у раној фази ПЦР реагенаса и одређивање најпогоднијих реакционих услова су предуслови да се обезбеди несметан напредак формалних експеримената.
Дакле, како треба да потврдимо сонду прајмера у раној фази?
Главни индикатори су основна линија, крива амплификације, цт вредност, ефикасност амплификације, детекција узорака ниске концентрације, ЦВ итд.
Баселине
Основна линија је хоризонтална линија у кривуљи ПЦР амплификације.У првих неколико циклуса реакције ПЦР амплификације, сигнал флуоресценције се не мења много и формира праву линију.Ова права линија је основна линија.
Приликом скрининга ПЦР прајмер сонди, обратите пажњу на то да ли је основна линија равна.Чистоћа концентрације прајмер сонде ће утицати на основну линију, као што је узрок пораста или пада основне линије.Основна линија је такође веома интуитиван индикатор.
Амплифицатион Цурве
Још један интуитиван индикатор је облик криве појачања.Најбоље је имати кривину у облику слова С да би се избегло секундарно појачање или друге абнормалне криве појачања.
Цт вредност
Број циклуса који одговара тачки прегиба од основне линије до експоненцијалног раста је Цт вредност.
За исти узорак, различите прајмер сонде доводе до различитих кривуља појачања, а на одговарајућу вредност Цт ће утицати ефикасност амплификације и степен интерференције.У теорији, што је мања вредност Цт прајмер сонде коју одаберемо, то боље.
Ефикасност појачања
Једна од најпоузданијих и најстабилнијих метода за процену ефикасности ПЦР амплификације је стандардна крива, која је такође широко призната од стране истраживача.Метода укључује прављење серије узорака за контролу релативног броја циљних шаблона.Ови узорци се обично праве серијским разблажењима концентрованих матичних раствора, а најчешће се користи 10-струко разблаживање.Користећи серију разблажених узорака, користећи стандардни кПЦР програм за амплификацију да бисте добили вредност Цк, и на крају нацртајте стандардну криву према концентрацији сваког узорка и одговарајућу вредност Цк да бисте добили линеарну једначину Цк= -клгКс0+б, и ефикасност амплификације Е=10(-1 /к)-1.Када се користи кПЦР за квантитативну анализу, потребно је да ефикасност амплификације буде у опсегу од 90%-110% (3,6>к>3,1).
Детекција узорака ниске концентрације
Када је концентрација узорка ниска, стопе детекције различитих прајмер сонди су различите.Одабрали смо 20 узорака ниске концентрације за реплицирање, а систем прајмер-сонда са највећом стопом детекције је најбољи.
Коефицијент варијације (ЦВ)
10 дупликата узорака може се детектовати различитим прајмер сондама у складу са линијским стандардом реагенса за детекцију амплификације нуклеинске киселине.
Квантитативни реагенси:
Прецизност
Тачност у оквиру једне серије треба да испуни: коефицијент варијације (ЦВ,%) логаритамске вредности испитне концентрације је ≤5%.Када је концентрација узорка ниска, коефицијент варијације (ЦВ,%) логаритма концентрације детекције је ≤10%
Квалитативни реагенси:
Прецизност
Тачност унутар једне серије треба да задовољи:
(1) Коефицијент варијације вредности Цт (ЦВ,%) ≤5%
Исти узорак се тестира паралелно 10 пута, а резултати испитивања треба да буду конзистентни
Време поста: 18.09.2021
