Верујем да ће се сви увек сусрести са оваквим или таквим проблемима када раде ПЦР реакције, али већина њих се може класификовати у два главна проблема:

Премало појачање шаблона гена (амплификација);
Превише нециљног појачања гена.
Употреба адитива је једна од уобичајених стратегија за решавање ових проблема.Обично улога адитива има два аспекта:
секундарна структурагена (секундарна структура);
Смањите неспецифично прајминг.
Данас ће вам уредник укратко представити уобичајене адитиве у ПЦР реакцијама и њихове функције.
Адитиви који смањују секундарну структуру
сулфоксид(ДМСО)
узорци генаса високим садржајем ГЦ .Међутим, ДМСО такође у великој мери смањује активност Так полимеразе.Стога, сви морају да уравнотеже доступност шаблона и активност полимеразе.Уредник предлаже да можете испробати различите концентрације ДСМО-а, на пример од 2% до 10%, да бисте пронашли концентрацију која одговара вашем експерименту.
Нејонски детерџенти
Нејонски детерџенти, као што су 0,1-1% Тритон Кс-100, Твеен 20 или НП-40, обично смањују секундарну структуру ДНК.Иако ово може повећати амплификацију шаблонског гена, такође ће изазвати проблеме неспецифичне амплификације.Дакле, ови адитиви добро функционишу за ПЦР реакције са малим приносом без остатака, али не тако добро за релативно нечисте ПРЦ реакције.Још једна предност нејонских детерџената је смањење контаминације СДС-ом.Обично током процеса екстракције ДНК, СДС ће бити доведен у ПЦР корак, који у великој мери инхибира активност полимеразе.Стога, додавање 0,5% Твеен-20 или Твеен-40 у реакцију може неутралисати негативне ефекте СДС.
Бетаин_
Бетаин може побољшати амплификацију ДНК смањењем формирања секундарне структуре и генерално је "мистериозни" додатак комерцијалним ПЦР комплетима.Ако желите да користите бетаин, треба ставити бетаин или бетаин моно-хидрат (Бетаин или Бетаине моно-хидрат), али не и бетаин хидрохлорид (Бетаин ХЦл), подесити на коначну концентрацију од 1-1,7М.Бетаин такође може помоћи у побољшању специфичности јер елиминише зависност од састава базног пара од топљења ДНК/денатурације ДНК.
Адитиви за смањење неспецифичног прајминга
Формамид
Формамид је уобичајено коришћен органски ПЦР адитив.Може да се комбинује са главним и мањим жлебом у ДНК, чиме се смањује стабилност главне ДНК двоструке спирале и снижава температура топљења ДНК.Концентрација формамида који се користи у ПЦР експериментима је обично 1%-5%.
Тетраметиламонијум хлорид( ТМАЦ)
Тетраметиламонијум хлорид може повећати специфичност хибридизације (специфичност хибридизације) и повећати температуру топљења ДНК.Дакле, ТМАЦ може уклонити неспецифично прајминг и смањити погрешно везивање ДНК и РНК.Ако користитедегенерисани прајмериу ПЦР реакцији, не заборавите да додате ТМАЦ, који се обично користи у концентрацији од 15-100 мМ.
Други уобичајени адитиви
Поред две горе поменуте категорије адитива, постоји много уобичајених адитива у ПЦР реакцијама, иако имају различите функције, такође су веома важни.
Магнезијум јон
Магнезијум јон је незаменљив кофактор (кофактор) полимеразе, односно без јона магнезијума полимераза је неактивна.Међутим, превише јона магнезијума такође може утицати на ефикасност полимеразе.Концентрација јона магнезијума у ​​свакој ПЦР реакцији ће варирати.Хелатни агенси (као што су ЕДТА или цитрат), концентрација дНТП и протеина утичу на концентрацију јона магнезијума.Дакле, ако имате проблема са својим ПЦР експериментом, можете покушати да промените различите концентрације јона магнезијума, на пример, од 1,0 до 4,0 мМ, са интервалом од 0,5–1 мМ између.
Вреди напоменути да вишеструки циклуси замрзавања-одмрзавања могу довести до стратификације концентрације раствора магнезијум хлорида.Због тога га морате потпуно растворити пре сваке употребе и добро промешати пре употребе.
Говеђи серум албумин(Говеђи албумин, БСА)
У експериментима молекуларне хемије, албумин говеђег серума је веома чест адитив, посебно у пробави рестрикцијским ензимима и ПЦР експериментима.У ПЦР реакцијама, БСА помаже у смањењу контаминаната као што су фенолна једињења.Такође се каже да може смањити адхезију реактаната на зид епрувете.У ПЦР реакцији, обично концентрација додатог БСА може да достигне 0,8 мг/мл.
 
Сродни производи:
ПЦР Херо(са бојом)
ПЦР Херо