Директни ПЦР је реакција која директно користи животињска или биљна ткива за амплификацију без екстракције нуклеинске киселине.На много начина, директни ПЦР функционише као обични ПЦР

Главна разлика је прилагођени пуфер који се користи у директном ПЦР-у, узорак се може директно подвргнути ПЦР реакцији без екстракције нуклеинске киселине, али постоје одговарајући захтеви за толеранцију ензима и компатибилност пуфера укљученог у директну ПЦР реакцију.

Иако у уобичајеним узорцима има мање или више ПЦР инхибитора, директни ПЦР ипак може постићи поуздану амплфикацију под дејством ензима и пуфера.Традиционална ПЦР реакција захтева висококвалитетну нуклеинску киселину као шаблон, који може инхибирати несметан напредак ПЦР реакције ако шаблон садржи протеине и друге нечистоће.Директни ПЦР је тренутно једна од популарнијих технологија у области молекуларне дијагностике.

01 Директни ПЦР је првобитно коришћен за животиње и биљке

Најранија примена директног ПЦР-а је у области животиња и биљака, као што су крв, ткиво и длака пацова, мачака, пилића, зечева, оваца, говеда итд., листови и семе биљака итд., Коришћени за проучавање генотипизације, трансгене, детекције плазмида, анализа гена, анализа извора ДНК, идентификација извора ДНК, идентификација других поља, идентификација врста.

Ова поља имају неке заједничке карактеристике, то јест, садржај циљног гена је релативно висок и екстракција нуклеинске киселине је проблематична, тако да директни ПЦР не само да може уштедети време и имати мали утицај на резултате, већ и уштедети трошкове.

Директан ПЦР који се користи за детекцију патогена је ствар последњих година, неки произвођачи ПЦР реагенса су уложили много напора у овом правцу када су правили иновације.Посебно у овој епидемији ЦОВИД-19, на тржишту су се појавили многи такви производи за детекцију, као што је комплет за детекцију САРС-ЦоВ-2 нуклеинске киселине (Мултиплек ПЦР флуоресцент Пробе Метход) који је истраживао и развио Форегене, који користи РТ ПЦР технологију у реалном времену (рРТ-ПЦР) за квалитативну детекцију насичких киселина или НАС-ЦоВ-2 САРСнуклеинске киселине код људи. узорци брисева из геала.

Форегене је једна од компанија која користи Дирецт ПЦР технологију, за детекцију нормалних ОРФ1аб, Н, Е иваријанта нуклеинске киселине у људским узорцима назофарингеалног или орофарингеалног бриса као што су САРС-ЦоВ-2 Б.1.1.7 линија (УК), Б.1.351 лоза (ЗА), Б.1.617 линија (ИНД) и П.1 линија (БР).

02  Реагенси потребни за директни ПЦР

Узорак лизата

Узорак лизата можете сами конфигурисати или купити.Разлика у саставу различитих марки лизата учиниће способност лизања различитом, а онда ће време лизања бити мало другачије.На пример, за припрему узорака животињског ткива генерално се препоручује лиза од 30 минута или преко ноћи, а раствор за лизу за вирусе се креће од 3-10 минута.

ПЦР мастер мик

Препоручује се употреба ДНК полимеразе са врућим стартом да би се побољшала специфична амплификација и повећала способност амплификације.Језгро директног ПЦР-а је високо толерантна полимераза.

Елиминишите или инхибирајте компоненте у узорку које утичу на амплификацију ДНК

Након што се узорак обради лизатом, ослобађају се протеини, липиди и други ћелијски остаци, ове супстанце ће инхибирати ПЦР реакцију.Стога, директни ПЦР захтева додавање одговарајућег уклањања или инхибитора да би се смањио утицај ових фактора.

03  Збирка од пет тачака знања директног ПЦР-а

Прво, Директна ПЦР технологија је директна ПЦР технологија за различите биолошке узорке.Под овим техничким условима, нема потребе за одвајањем и екстраховањем нуклеинске киселине, директном употребом узорка ткива као објекта и додавањем прајмера циљног гена за извођење ПЦР реакције.

Друго, Директна ПЦР технологија није само традиционална технологија амплификације ДНК шаблона, већ такође укључује ПЦР реверзну транскрипцију РНА шаблона.

Треће, Директна ПЦР технологија не само да директно изводи рутинске квалитативне ПЦР реакције на узорцима ткива, већ укључује и кПЦР реакције у реалном времену, што захтева да реакциони систем има снажну способност анти-позадинске интерференције флуоресценције, а ендогена флуоресценција гаси антагонистичку способност.

Четврто, узорци који су циљани директном ПЦР технологијом требају само ослобађање шаблона нуклеинских киселина и не уклањају протеине, полисахариде, јоне соли, итд. који ометају ПЦР реакцију.Што захтева да полимераза нуклеинске киселине и ПЦР мешавина у реакционом систему имају одличну отпорност и прилагодљивост како би се осигурала активност ензима и тачност репликације у сложеним условима.

Пето, узорак ткива циљаног директном ПЦР технологијом без икаквог третмана обогаћивања нуклеинском киселином и количина шаблона је веома мала, што захтева да реакциони систем има изузетно високу осетљивост и ефикасност амплификације.