Изванредна карактеристика ПЦР реакције је њен велики капацитет амплификације и изузетно висока осетљивост.Да бисмо побољшали ПЦР перформансе и ефикасност детекције, посвећени смо побољшању капацитета ПЦР амплификације и осетљивости детекције, али главобоља је у процесу експеримента.Често се јављају лажно позитивни резултати, а врло мала количина унакрсне контаминације узорка или контаминације ПЦР производа може изазвати лажно позитивне резултате у експерименту.
Пет врста контаминације ПЦР производа
Постоји много разлога за ПЦР контаминацију, који се грубо могу поделити у следеће категорије:
Контаминација узорка је углавном узрокована контаминацијом контејнера за сакупљање узорка, или када се узорак постави, он исцури из контејнера због лабавог заптивања, или је узорак залепљен за спољашњу страну контејнера, што узрокује унакрсну контаминацију;Контаминација доводи до контаминације између узорака;неки микробиолошки узорци, посебно вируси, могу се ширити аеросолима или формирати аеросоле, што резултира међусобном контаминацијом.
Главни разлог је то што су током припреме ПЦР реагенса пиштољ за узорке, контејнер, двоструко дестилована вода и други раствори контаминирани шаблоном нуклеинске киселине за ПЦР.
У лабораторијама за молекуларну биологију и неким лабораторијама које користе клониране плазмиде као позитивне контроле, проблем контаминације клонираним плазмидом је такође чест.Пошто је садржај клонирајућег плазмида у јединичној запремини прилично висок, и потребно је више алата и реагенса у процесу пречишћавања, а велика је вероватноћа да ће плазмид у живим ћелијама бити контаминиран због снажног раста и способности репродукције живих ћелија.
Контаминација амплифицираних производа је најчешћи проблем контаминације у ПЦР реакцијама.Пошто је количина копија ПЦР производа велика (обично 1013 копија/мл), што је далеко више од границе броја копија за детекцију ПЦР-а, врло мала количина контаминације ПЦР производа може изазвати лажне позитивне резултате.
Загађење аеросолом је највероватнији облик контаминације ПЦР производа, а такође га је и најлакше превидети.Настаје трењем између површине течности и ваздуха.Генерално, аеросолна контаминација може да се формира када се поклопац отвори, када се узорак усисава, или чак када се реакциона епрувета снажно протресе.Према прорачунима, честица аеросола може да садржи 48.000 копија, па је загађење које њоме изазива проблем који заслужује посебну пажњу.
Конкретно, лабораторије за тестирање често користе исти пар прајмера за тестирање одређеног гена.Временом ће се у лабораторијском простору појавити велика количина контаминације ПЦР производа.Једном када дође до такве контаминације, тешко је елиминисати је за кратко време.
За прве три врсте загађења можемо користити ефикасна средства за избегавање, али је загађење изазвано ПЦР производима тешко спречити, посебно у изградњи нестандардних ПЦР лабораторија.У ПЦР процесу, када врх пипете усисава и издува течност, а поклопац ПЦР цеви се отвори, формираће се аеросол.Молекуле ДНК које носи аеросол (један аеросол може да носи десетине хиљада ДНК) је тешко елиминисати јер лебде у ваздуху.Када се уведе следећи круг ПЦР експеримената, неизбежно ће доћи до лажних позитивних резултата.
Као што је приказано на слици испод, негативна контрола је такође појачала одговарајући опсег интересовања:
Овде је представљен први део овог питања ПЦР загађења и превенције.Следећи број доноси вам други део „Превенција контаминације ПЦР производа“, па останите са нама!
Време објаве: 25.07.2017
