Технологија молекуларне дијагностике користи методе молекуларне биологије за откривање експресије и структуре генетског материјала људског тела и различитих патогена, како би се постигла сврха предвиђања и дијагностиковања болести.

Последњих година, са надоградњом и итерацијом технологије молекуларне дијагностике, клиничка примена молекуларне дијагностике постаје све обимнија и продубљива, а тржиште молекуларне дијагностике је ушло у период брзог развоја.

Аутор сумира уобичајене технологије молекуларне дијагностике на тржишту и подељен је на три дела: први део представља ПЦР технологију, други део представља технологију изотермне амплификације нуклеинске киселине, а други део технологију секвенцирања.

01

Део И: ПЦР технологија

ПЦР технологија

ПЦР (ланчана реакција полимеразе) је једна од технологија ин витро амплификације ДНК, са историјом дужом од 30 година.

ПЦР технологију је 1983. године увео Кари Муллис из Цетуса, САД.Муллис се пријавио за ПЦР патент 1985. године и објавио први ПЦР академски рад о науци исте године.Мулис је добио Нобелову награду за хемију 1993.

Основни принципи ПЦР-а

ПЦР може да појача фрагменте циљне ДНК више од милион пута.Принцип је да се под катализом ДНК полимеразе, родитељски ланац ДНК користи као шаблон, а специфични прајмер се користи као полазна тачка за продужавање.Реплицира се ин витро кроз кораке као што су денатурација, жарење и екстензија.Процес ћерки ланца ДНК комплементаран матичном ланцу шаблон ДНК.

Стандардни ПЦР процес је подељен у три корака:

1. Денатурација: Користите високу температуру да бисте одвојили двоструке ланце ДНК.Водоничне везе између двоструких ланаца ДНК прекидају се на високим температурама (93-98°Ц).

2. Жарење: Након што је дволанчана ДНК одвојена, температура се снижава тако да се прајмер може везати за једноланчану ДНК.

3. Продужетак: ДНК полимераза почиње да синтетише комплементарне ланце дуж ланаца ДНК од везаних прајмера када се температура спусти.Када је проширење завршено, циклус је завршен, а број фрагмената ДНК се удвостручује.

Узвраћањем ова три корака 25-35 пута, број фрагмената ДНК ће се експоненцијално повећати.

Генијалност ПЦР-а је у томе што се различити прајмери ​​могу дизајнирати за различите циљне гене, тако да се фрагменти циљног гена могу амплифицирати у кратком временском периоду.

До сада се ПЦР може поделити у три категорије, а то су обични ПЦР, флуоресцентни квантитативни ПЦР и дигитални ПЦР.

Прва генерација обичног ПЦР-а

Користите обичан инструмент за ПЦР амплификацију да појачате циљни ген, а затим користите електрофорезу у агарозном гелу за детекцију производа, може се урадити само квалитативна анализа.

Главни недостаци ПЦР прве генерације:

-Склон неспецифичном појачавању и лажно позитивним резултатима.

-Откривање траје дуго и операција је гломазна.

-Може се урадити само квалитативно испитивање.

Квантитативни ПЦР флуоресценције друге генерације

Квантитативни флуоресцентни ПЦР (ПЦР у реалном времену), такође познат као кПЦР, користи се за праћење акумулације појачаних производа кроз акумулацију флуоресцентних сигнала додавањем флуоресцентних сонди које могу да укажу на напредак реакционог система, као и за процену резултата кроз криву флуоресценције, а може се квантификовати и помоћу стандардне криве Цк.

Пошто се кПЦР технологија спроводи у затвореном систему, вероватноћа контаминације је смањена, а сигнал флуоресценције се може пратити за квантитативну детекцију, тако да је најшире коришћена у клиничкој пракси и постала је доминантна технологија у ПЦР-у.

Флуоресцентне супстанце које се користе у флуоресцентном квантитативном ПЦР-у у реалном времену могу се поделити на: ТакМан флуоресцентне сонде, молекуларне светионике и флуоресцентне боје.

1) ТакМан флуоресцентна сонда:

Током ПЦР амплификације, специфична флуоресцентна сонда се додаје уз додавање пара прајмера.Сонда је олигонуклеотид, а два краја су означена са репортерском флуоресцентном групом и флуоресцентном групом за гашење.

Када је сонда нетакнута, флуоресцентни сигнал који емитује репортерска група апсорбује група за гашење;током ПЦР амплификације, 5′-3′ егзонуклеазна активност ензима Так цепа и деградира сонду, чинећи репортерску флуоресцентну групу и гаситељ. Флуоресцентна група је одвојена, тако да систем за праћење флуоресценције може да прими сигнал флуоресценције, то јест, сваки пут када се формира флуоресцентни ланац флуоресцентне ДНК и формира се молекул флуоресценције флуоресценције. сценски сигнал је потпуно синхронизован са формирањем ПЦР производа.

2) СИБР флуоресцентне боје:

У ПЦР реакционом систему се додаје вишак СИБР флуоресцентне боје.Након што је СИБР флуоресцентна боја неспецифично уграђена у двоструки ланац ДНК, емитује флуоресцентни сигнал.Молекул СИБР боје који није уграђен у ланац неће емитовати никакав флуоресцентни сигнал, чиме се обезбеђује флуоресцентни сигнал. Повећање ПЦР производа је потпуно синхронизовано са повећањем ПЦР производа.СИБР се везује само за дволанчану ДНК, тако да се крива топљења може користити да се утврди да ли је ПЦР реакција специфична.

3) Молекуларни светионици

То је двоструко обележена олигонуклеотидна сонда у облику петље која формира структуру укоснице од око 8 база на 5 и 3 краја.Секвенце нуклеинске киселине на оба краја су комплементарно упарене, што узрокује да су флуоресцентна група и група за гашење тесне.Затвори, неће производити флуоресценцију.

Након што се ПЦР производ генерише, током процеса жарења, средњи део молекуларног сигнала се упарује са специфичном секвенцом ДНК, а флуоресцентни ген се одваја од гена за гашење да би се произвела флуоресценција.

Главни недостаци ПЦР друге генерације:

Осетљивост још увек недостаје, а детекција узорака са мало копије није тачна.

Постоји утицај позадинске вредности, а резултат је подложан сметњама.

Дигитални ПЦР треће генерације

Дигитални ПЦР (ДигиталПЦР, дПЦР, Диг-ПЦР) израчунава број копија циљне секвенце кроз детекцију крајње тачке и може да изврши тачну апсолутну квантитативну детекцију без употребе интерних контрола и стандардних кривих.

Дигитални ПЦР користи детекцију крајњих тачака и не зависи од вредности Цт (праг циклуса), тако да на дигиталну ПЦР реакцију мање утиче ефикасност амплификације, а толеранција на инхибиторе ПЦР реакције је побољшана, са високом прецизношћу и репродуктивношћу.

Због карактеристика високе осетљивости и високе тачности, инхибитори ПЦР реакције га не ометају лако, а може постићи праву апсолутну квантификацију без стандардних производа, што је постало жариште истраживања и примене.

Према различитим облицима реакционе јединице, може се поделити на три типа: микрофлуидни, чип и системи капљица.