Цт вредност је најважнији облик презентације резултата флуоресцентног квантитативног ПЦР-а.Користи се за израчунавање разлика у експресији гена или броја копија гена.Дакле, која се вредност Цт квантификације флуоресценције сматра разумном?Како осигурати ефективни опсег вредности Цт?
Шта је Цт вредност?
Током процеса кПЦР амплификације, одговарајући број циклуса амплификације (Цицле Тхресхолд) када сигнал флуоресценције појачаног производа достигне постављени праг флуоресценције.Ц означава циклус, а Т означава праг.Једноставно речено, вредност Цт је број циклуса који одговара тренутку када почетна амплификација шаблона достигне одређену количину производа у кПЦР.Такозвана „одређена количина производа“ ће бити додатно објашњена касније.
Шта ради вредност Цт?
1. Однос између експоненцијалног појачања, количине шаблона и вредности Цт
У идеалном случају, гени у кПЦР-у се акумулирају експоненцијалном амплификацијом након одређеног броја циклуса.Однос између броја циклуса појачања и количине производа је: Количина појачаног производа = почетна количина шаблона × (1+Ен) број циклуса.Међутим, кПЦР реакција није увек у идеалној ситуацији.Када количина појачаног производа достигне „одређену количину производа“, број циклуса у овом тренутку је вредност Цт и налази се у периоду експоненцијалног појачања.Однос између вредности Цт и количине почетног шаблона: Постоји линеарна веза између вредности Цт шаблона и логаритма почетног броја копије шаблона.Што је већа почетна концентрација шаблона, то је мања вредност Цт;што је нижа почетна концентрација шаблона, већа је вредност Цт.
2. Крива амплификације, праг флуоресценције и одређена количина ПЦР производа
Количина производа кПЦР амплификације је директно представљена у облику флуоресцентног сигнала, односно криве амплификације.У раној фази ПЦР-а, амплификација је у идеалним условима, број циклуса је мали, акумулација производа је мала, а ниво флуоресценције се не може јасно разликовати од позадине флуоресценције.Након тога, флуоресценција се повећава и улази у експоненцијалну фазу.Количина ПЦР производа може се детектовати у одређеном тренутку када је ПЦР реакција управо у експоненцијалној фази, што се може користити као „одређена количина производа“, а из тога се може закључити почетни садржај шаблона.Према томе, интензитет сигнала флуоресценције који одговара одређеној количини производа је праг флуоресценције.
У касној фази ПЦР-а, крива амплификације више не показује експоненцијално појачање, и улази у линеарну фазу и фазу платоа.
3. Репродуцибилност вредности Цт
Када ПЦР циклус достигне број циклуса вредности Цт, управо је ушао у прави период експоненцијалне амплификације.У овом тренутку, мала грешка није појачана, тако да је поновљивост вредности Цт одлична, односно исти шаблон се појачава у различито време или у различитим епруветама у исто време.Амплификација, добијена вредност Цт је константна.
1. Ефикасност појачања Ен
Ефикасност ПЦР амплификације се односи на ефикасност којом полимераза претвара ген који треба да се амплифицира у ампликон.Ефикасност амплификације када се један молекул ДНК трансформише у два ДНК молекула је 100%.Ефикасност амплификације се обично изражава као Ен.Да би се олакшала анализа наредних чланака, укратко су представљени фактори који утичу на ефикасност амплификације.
| Фактори утицаја | објашњење | Како судити? |
| А. ПЦР инхибитори | 1. ДНК шаблона садржи супстанце које инхибирају ПЦР реакцију, као што су протеини или детерџенти.2. цДНК након реверзне транскрипције садржи високу концентрацију шаблонске РНК или компоненти РТ реагенса, који такође могу инхибирати накнадну ПЦР реакцију. | 1. Да ли постоји загађење може се проценити мерењем односа А260/А280 и А260/А230 или РНК електрофорезом.2. Да ли је цДНК разређена у одређеном односу након реверзне транскрипције. |
| Б. Неправилан дизајн прајмера | Прајмери се не жаре ефикасно | Проверите да ли прајмери имају димере или укоснице, неподударности, а понекад и интронске дизајне. |
| Ц. Неправилан дизајн програма ПЦР реакције | 1. Прајмери не могу ефикасно жарити2. Недовољно ослобађање ДНК полимеразе 3. Дуготрајна високотемпературна активност ДНК полимеразе смањена | 1. Температура жарења је виша од ТМ вредности прајмера2. Време предденатурације је прекратко 3. Време сваке фазе реакционог поступка је предуго |
| Д. Недовољно мешање реагенаса или грешке у пипетирању | У реакционом систему, локална концентрација компоненти ПЦР реакције је превисока или неуједначена, што доводи до неекспоненцијалног појачања ПЦР амплификације | |
| Е. Дужина ампликона | Дужина ампликона је предугачка, прелази 300бп, а ефикасност амплификације је ниска | Проверите да ли је дужина ампликона између 80-300бп |
| Ф. Утицај кПЦР реагенаса | Концентрација ДНК полимеразе у реагенсу је ниска или концентрација јона у пуферу није оптимизована, што доводи до тога да активност Так ензима не достиже максимум | Одређивање ефикасности појачања стандардном кривом |
2.Распон вредности Цт
Цт вредности се крећу од 15-35.Ако је вредност Цт мања од 15, сматра се да је појачање унутар опсега базног периода и да праг флуоресценције није достигнут.У идеалном случају, постоји линеарна веза између вредности Цт и логаритма почетног броја копије шаблона, односно стандардне криве.Кроз стандардну криву, када је ефикасност амплификације 100%, израчуната вредност Цт за квантификацију броја појединачне копије гена је око 35. Ако је већи од 35, почетни број копија шаблона је теоретски мањи од 1, што се може сматрати бесмисленим.
За различите Цт опсеге гена, због разлике у броју копија гена и ефикасности амплификације у почетној количини шаблона, потребно је направити стандардну криву за ген и израчунати опсег линеарне детекције гена.
3.Утицајни фактори вредности Цт
Из односа између броја циклуса појачања и количине производа: количина појачаног производа = количина почетног шаблона × (1+Ен) број циклуса, може се видети да ће у идеалним условима количина почетног шаблона и Ен имати негативан утицај на вредност Цт.Разлика у квалитету шаблона или ефикасности појачања ће узроковати да вредност Цт буде превелика или премала.
4.Цт вредност је превелика или премала
Време поста: 22. фебруар 2023
