ПЦР је најраспрострањенија технологија амплификације нуклеинских киселина и широко се користи због своје осетљивости и специфичности.Међутим, ПЦР захтева поновну термичку денатурацију и не може се ослободити ограничења ослањања на инструменте и опрему, што ограничава његову примену у клиничком тестирању на терену.

Од раних 1990-их, многе лабораторије су почеле да развијају технологију појачања константне температуре која не захтева термичку денатурацију.Сада су развили технологију изотермне амплификације посредоване петљом, технологију изотермне амплификације замене ланаца, технологију изотермне амплификације кружног круга и зависност секвенце нуклеинске киселине.Технологија изотермног појачања и друге технологије. 

Lооп посредовано изотермно појачање

Принцип амплификације је заснован на чињеници да је ДНК у стању динамичке равнотеже на око 65°Ц.Када је било који прајмер упарен базама и проширен на комплементарни део дволанчане ДНК, други ланац ће се одвојити и постати једноланчан.

На овој температури, ДНК користи 4 специфична прајмера да се ослони на ДНК полимеразу са померањем ланца како би синтеза ДНК са померањем ланца континуирано циркулисала.

Прво одредите 6 специфичних региона Ф3, Ф2, Ф1, Б1, Б2, Б3 на циљном гену, а затим дизајнирајте 4 прајмера на основу ових 6 специфичних региона (као што је приказано на слици испод):

Предњи унутрашњи прајмер (ФИП) се састоји од Ф1ц и Ф2.

Повратни унутрашњи прајмер (БИП) се састоји од Б1ц и Б2, а ТТТТ се користи као одстојник у средини.

Спољни прајмери ​​Ф3 и Б3 се састоје од Ф3 и Б3 региона на циљном гену.

У ЛАМП реакционом систему, концентрација унутрашњег прајмера је неколико пута већа од спољашњег прајмера.Унутрашњи прајмер се прво комбинује са ланцем шаблона да би се синтетизовао комплементарни ланац да би се формирао двоструки ланац ДНК.Након тога, спољашњи прајмер се комбинује са ланцем шаблона да би се формирао двоструки ланац ДНК.Под дејством БстДНК полимеразе ослобађа се комплементарни ланац синтетизован унутрашњим прајмером.После низа реакција, комплементарни ланац коначно формира један ДНК ланац са структуром бучице.

Сама ДНК структуре бучице се користи као шаблон за континуирано формирање ДНК прелазне структуре стабла и петље са отвореним крајем.Унутрашњи и спољашњи прајмери ​​воде ДНК прелазне структуре петље стабла да континуирано пролази кроз реакције померања и продужетка ланца, и коначно формирају вишеструке структуре петље стабла различитих дужина.ДНК мешавина.

Предности и недостаци изотермног појачања посредованог петљом

Предности ЛАМП-а:

(1) Висока ефикасност амплификације, која може ефикасно да амплифицира 1-10 копија циљног гена у року од 1 сата, а ефикасност амплификације је 10-100 пута већа од обичног ПЦР-а.

(2) Време реакције је кратко, специфичност је јака и није потребна посебна опрема.

Недостаци ЛАМП-а:

(1) Захтеви за прајмере су посебно високи.

(2) Умножени производ се не може користити за клонирање и секвенцирање, већ се може користити само за процену.

(3) Због своје јаке осетљивости, лако је формирати аеросоле, што изазива лажне позитивне резултате и утиче на резултате теста.

Sпојачање померања транда

Амплификација померања ланаца (СДА) је ин витро техника изотермне амплификације ДНК заснована на ензимској реакцији коју је први предложио амерички научник Вокер 1992. године.

Основни систем СДА укључује рестрикцијску ендонуклеазу, ДНК полимеразу са активношћу померања ланца, два пара прајмера, дНТП, и јоне калцијума и магнезијума и пуферске системе.

Принцип амплификације померања ланца заснива се на хемијски модификованој секвенци препознавања рестрикционе ендонуклеазе на оба краја циљне ДНК.Ендонуклеаза отвара празнину у ланцу ДНК на месту његовог препознавања, а ДНК полимераза проширује празнину 3′ Енд и замењује следећи ланац ДНК.

Замењени појединачни ланци ДНК могу се комбиновати са прајмерима и проширити у двоструке ланце помоћу ДНК полимеразе.Овај процес се непрекидно понавља, тако да се циљна секвенца ефикасно појачава.

Предности и недостаци технологије појачања померања прамена

Предности СДА:

Ефикасност амплификације је висока, време реакције је кратко, специфичност је јака и није потребна посебна опрема.

Недостаци СДА:

Производи нису уједначени, а неки једноланчани и дволанчани производи се увек производе у СДА циклусу, а реп ће се неизбежно појавити када се детектује електрофорезом.

Rоллинг круг појачање

Амплификација котрљајућим кругом (РЦА) се предлаже коришћењем методе копирања ДНК из патогених организама котрљајућим кругом.Односи се на употребу једноланчане кружне ДНК као шаблона на константној температури и специјалне ДНК полимеразе (као што је Пхи29) ) Под дејством синтезе ДНК кружног тока да би се постигла амплификација циљног гена.

РЦА се може поделити на линеарно појачање и експоненцијално појачање.Ефикасност линеарног РЦА може да достигне 10⁵пута, а ефикасност експоненцијалног РЦА може да достигне 10⁹пута.

Једноставна разлика, као што је приказано на слици испод, линеарна амплификација а користи само 1 прајмер, експоненцијална амплификација б има 2 прајмера.

Линеарни РЦА се такође назива РЦА са једним прајмером.Прајмер се везује за кружну ДНК и продужава се деловањем ДНК полимеразе.Производ је линеарни појединачни ланац са великим бројем понављајућих секвенци хиљадама пута дужине једне петље.

Пошто је производ линеарног РЦА увек повезан са почетним прајмером, лака фиксација сигнала је велика предност.

Експоненцијални РЦА, такође познат као Хипер разгранато појачање ХРЦА (Хипер разгранати РЦА), у експоненцијалном РЦА, један прајмер појачава РЦА производ, други прајмер се хибридизује са РЦА производом и продужава, а замена је већ везана за РЦА производ.

Предности и недостаци амплификације нуклеинских киселина у круговима

Предности РЦА:

Висока осетљивост, добра специфичност и једноставан рад.

Недостаци РЦА:

Проблеми у позадини током детекције сигнала.Током РЦА реакције, сонда катанца која није циркулисана и ДНК или РНК шаблона невезане сонде могу да генеришу неке позадинске сигнале. 

Nамплификација заснована на секвенци уклеинске киселине

Амплификација заснована на секвенци нуклеинске киселине (НАСБА) је нова технологија развијена на бази ПЦР.То је континуирана и изотермна амплификација нуклеинске киселине вођена паром прајмера са Т7 промоторском секвенцом.Технологија може појачати шаблонску РНК за око 109 пута за око 2 сата, што је 1000 пута више од конвенционалне ПЦР методе и не захтева посебну опрему.

Ова технологија се користи за брзу дијагнозу болести чим се појави, а многе компаније тренутно користе ову методу у комплетима за детекцију РНК.

Иако РНК амплификација такође може да користи ПЦР технологију реверзне транскрипције, НАСБА има своје предности: може се извести под релативно константним температурним условима и стабилнија је и прецизнија од традиционалне ПЦР технологије.

Реакција је на 41 степен Целзијуса и захтева реверзну транскриптазу АМВ (вирус мијелобластозе птица), РНазу Х, Т7 РНК полимеразу и пар прајмера да се заврши.

Процес углавном укључује:

Предњи прајмер садржи комплементарну секвенцу Т7 промотера.Током реакције, предњи прајмер се везује за РНК ланац и катализује га ензим АМВ да би се формирао двоструки ланац ДНК-РНК.

РНаза Х вари РНК у хибридном дволанчаном и задржава једноланчану ДНК.

Под дејством реверзног прајмера и ензима АМВ, формира се двоструки ланац ДНК који садржи секвенцу промотера Т7.

Под дејством Т7 РНК полимеразе, процес транскрипције се завршава и ствара се велика количина циљне РНК.

Предности НАСБА:

(1) Његов прајмер има секвенцу Т7 промотера, али страна дволанчана ДНК нема секвенцу Т7 промотера и не може се појачати, тако да ова технологија има високу специфичност и осетљивост.

(2) НАСБА директно укључује процес реверзне транскрипције у реакцију амплификације, скраћујући време реакције.

Недостаци НАСБА:

(1) Компоненте реакције су компликованије.

(2) Потребне су три врсте ензима да би цена реакције била већа.