Неколико револуционарних проналазака у историји технологије детекције у мом уму су технологија имуно-обележавања заснована на принципу специфичног везивања антиген-антитело, ПЦР технологија и технологија секвенцирања.Данас ћемо говорити о ПЦР технологији.Према еволуцији ПЦР технологије, људи уобичајено деле ПЦР технологију у три генерације: обичну ПЦР технологију, флуоресцентну квантитативну ПЦР технологију у реалном времену и дигиталну ПЦР технологију.
Cуобичајена ПЦР техника
КАРИ МУЛЛИС (1944.12.28-2019.8.7)
Кари Муллис је измислио ланчану реакцију полимеразе (полимерасе цхаин респонсе , ПЦР) 1983. године. Кажу да је, док је возио своју девојку, изненада добио бљесак инспирације и помислио на принцип ПЦР (о предностима вожње).Кари Муллис је добио Нобелову награду за хемију 1993. Њујорк Тајмс је коментарисао: „Веома оригиналан и значајан, скоро дели биологију на пре-ПЦР и пост-ПЦР ере.
Принцип ПЦР-а: Под катализом ДНК полимеразе, ДНК матичног ланца се користи као шаблон, а специфични прајмер се користи као почетна тачка екстензије, а ДНК ћерке ланца комплементарна ДНК шаблона матичног ланца се копира ин витро кроз денатурацију, жарење, продужавање и друге кораке.То је технологија амплификације синтезе ДНК ин витро, која може брзо и специфично појачати било коју циљну ДНК ин витро.
Предности обичног ПЦР-а
1.Класична метода, потпуни међународни и домаћи стандарди
2.Нижа цена реагенаса за инструменте
3.ПЦР производи се могу добити за друге експерименте молекуларне биологије
Препоручена Форегене ПЦР машина: хттпс://ввв.фореивд.цом/фореамп-сн-695-сериес-тхермал-цицлер-96-веллс-пцр-мацхине-продуцт/
Сродни производи: хттпс://ввв.фореивд.цом/пцр-херотм-витх-дие-продуцт/
Недостаци обичног ПЦР-а
1.лако загадити
2.гломазна операција
3.само квалитативна анализа
4.Умерена осетљивост
5.Постоји неспецифично појачање, а када је неспецифична трака исте величине као циљна трака, не може се разликовати
CПЦР на бази апиларне електрофорезе
Као одговор на недостатке обичног ПЦР-а, неки произвођачи су увели инструменте засноване на принципу капиларне електрофорезе.Корак електрофорезе након ПЦР амплификације је завршен у капилари.Осетљивост је већа, а разлика неколико база се може разликовати и појачање се може израчунати помоћу МАЕРКЕР-а.садржај производа.Недостатак је што ПЦР производ још увек треба да се отвори и стави у инструмент, а и даље постоји велики ризик од контаминације.
CапиларниEелектрофореза
2. флуоресцентна квантитативна ПЦР (квантитативни ПЦР у реалном времену, кПЦР) технологија у реалном временуФлуоресцентни квантитативни ПЦР, такође назван ПЦР у реалном времену, је нова квантитативна технологија нуклеинске киселине коју је развио ПЕ (Перкин Елмер) 1995. Историја развоја флуоресцентног квантитативног ПЦР-а је историја узбудљивих борби дивова као што су АБИ, Роцхе и Био-Рад.Ако сте заинтересовани, можете погледати.Ова техника је тренутно најзрелија и широко коришћена полуквантитативна ПЦР техника.
Препоручена кПЦР машина: хттпс://ввв.фореивд.цом/мини-реал-тиме-пцр-систем-форекуант-сф2сф4-продуцт/
Метода флуоресцентне боје (СИБР Греен И):СИБР Греен И је најчешће коришћена боја за везивање ДНК за квантитативни ПЦР, која се неспецифично везује за дволанчану ДНК.У слободном стању, СИБР Греен емитује слабу флуоресценцију, али када се једном веже за дволанчану ДНК, његова флуоресценција се повећава 1000 пута.Према томе, укупан флуоресцентни сигнал који емитује реакција је пропорционалан количини присутне дволанчане ДНК и повећаваће се са повећањем амплификованог производа.Пошто се боја неспецифично везује за дволанчану ДНК, могу се генерисати лажно позитивни резултати.
Сродни производи: хттпс://ввв.фореивд.цом/реал-тиме-пцр-еаситм-сибр-греен-и-кит-продуцт/
Метода флуоресцентне сонде (Такман технологија): ТокомПЦР амплификација, специфична флуоресцентна сонда се додаје у исто време као и пар прајмера.Сонда је линеарни олигонуклеотид, са флуоресцентном репортерском групом и флуоресцентном групом за гашење, респективно, обележеним на оба краја.Када је сонда нетакнута, флуоресцентни сигнал који емитује репортерска група апсорбује група за гашење, а детекција Нема флуоресцентног сигнала;током ПЦР амплификације (у фази екстензије), 5'-3' Дицер активност Так ензима ће пробавити и деградирати сонду, тако да се репортерска флуоресцентна група и гаситељска флуоресцентна група раздвоје, тако да систем за праћење флуоресценције. флуоресцентни сигнали и формирање ПЦР производа.Метода Такман сонде је најчешће коришћена метода детекције у клиничкој детекцији.
Сродни производи: хттпс://ввв.фореивд.цом/куицкеаси%е1%б5%80%е1%б4%б9-реал-тиме-пцр-кит-такман-продуцт/
Предности кПЦР-а
1.Метода је зрела и пратећа опрема и реагенси су комплетни
2.Средња цена реагенса
3.једноставан за коришћење
4.Висока осетљивост и специфичност детекције
Недостаци кПЦР-а
Мутација циљног гена доводи до промашене детекције.
Не може се одредити резултат детекције шаблона ниске концентрације.
Постоји велика грешка када се користи стандардна крива за квантитативну детекцију.
3. Дигитал ПЦР (дигитални ПЦР, дПЦР) технологија
Дигитални ПЦР је техника за апсолутну квантификацију молекула нуклеинске киселине.У поређењу са кПЦР, дигитални ПЦР може директно да очита број молекула ДНК/РНА, што је апсолутна квантификација молекула нуклеинске киселине у почетном узорку.Године 1999, Берт Вогелстеин и Кеннетх В. Кин-злер су званично предложили концепт дПЦР.
Флуидигм је 2006. године први произвео комерцијални дПЦР инструмент заснован на чипу.Године 2009. Лифе Тецхнологиес је лансирао системе ОпенАрраи и КуантСтудио 12К Флек дПЦР.Године 2013. Лифе Тецхнологиес је лансирао КуантСтудио 3ДдПЦР систем, који користи технологију микрофлуидних чипова високе густине за равномерну дистрибуцију узорака на 20.000 појединачних ћелија.у реакционом бунару.
Године 2011. Био-Рад је лансирао ККС100 дПЦР инструмент заснован на капљицама, који користи технологију вода у уљу за равномерну дистрибуцију узорка на 20.000 капљица воде у уљу и користи анализатор капљица за анализу капљица.У 2012, РаинДанце је лансирао РаинДроп дПЦР инструмент, покретан гасом под високим притиском, да подели сваки стандардни реакциони систем у реакциону емулзију која садржи 1 милион до 10 милиона микрокапљица на нивоу пиколитара.
До сада је дигитални ПЦР формирао две главне фракције, тип чипа и тип капљице.Без обзира на врсту дигиталног ПЦР-а, његови основни принципи су ограничавање разблаживања, ПЦР крајње тачке и Поиссонова дистрибуција.Стандардни ПЦР реакциони систем који садржи шаблоне нуклеинских киселина је равномерно подељен на десетине хиљада ПЦР реакција, које се расподељују на чипове или микрокапљице, тако да свака реакција садржи што више молекула шаблона, а изводи се једномолекулска шаблонска ПЦР реакција.Очитавањем флуоресценције Присуство или одсуство сигнала се броји, а апсолутна квантификација се врши након калибрације статистичке Поиссонове дистрибуције.
Следе карактеристике неколико дигиталних ПЦР платформи које сам користио:
1. Био-Рад ККС200 дигитални ПЦР Био-РадККС200 је веома класична дигитална ПЦР платформа, основни процес детекције: 20.000 узорака се генерише помоћу генератора капљица. Микро-капљице воде у уљу се појачавају на обичној ПЦР машини, а на крају се флуоресцентни сигнал сваке микрокапљице чита читачем микро-капљица.Операција је компликованија, а ризик од загађења је средњи.
Ксинии ТД1 микро-капљични дигитални ПЦРКсинии ТД1 је домаћа дигитална ПЦР платформа, основни процес детекције: генерише 30.000-50.000 капљица воде у уљу кроз генератор капљица, појачава на уобичајеном ПЦР инструменту и на крају пропушта Читач капљица чита флуоресцентни сигнал сваке капљице.И генерисање капљица и читање на овој платформи се обављају у наменском чипу са малим ризиком од контаминације.
СТИЛЛА Наица микро-капљични чип дигитални ПЦРСТИЛЛА Наица је релативно нова дигитална ПЦР платформа.Основни процес детекције је: додати реакциони раствор у чип, ставити чип у систем за генерисање и појачавање микро-капљица и генерисати 30.000 микро-капљица.Ширите се на чип, а ПЦР амплификација је завршена на чипу.Затим се појачани чип преноси у систем за анализу читања микро-капљица, а флуоресцентни сигнал се чита сликањем.Пошто се цео процес одвија у затвореном чипу, ризик од контаминације је низак.
4. ТхермоФисхер КуантСтудио 3Д чип дигитални ПЦР
ТхермоФисхер КуантСтудио 3Д је још једна класична дигитална ПЦР платформа заснована на чипу.Његов основни процес детекције је: додати реакциони раствор у распршивач и равномерно распоредити реакциони раствор по чипу са 20.000 микро-удубљења кроз распршивач., ставите чип на ПЦР машину да се појача, и на крају ставите чип у читач и снимите фотографију да бисте прочитали флуоресцентни сигнал.Операција је релативно компликована, а цео процес се одвија у затвореном чипу, а ризик од контаминације је низак.
5. ЈН МЕДСИС Цларити чип дигитални ПЦР
ЈН МЕДСИС Цларити је релативно нова дигитална ПЦР платформа типа чип.Његов основни процес детекције је: додати реакциони раствор у апликатор и равномерно распоредити реакциони раствор на 10.000 ПЦР епрувета причвршћених у ПЦР епрувети кроз апликатор.На микропорозном чипу, реакциони раствор улази у чип кроз капиларно дејство, а ПЦР цев са чипом се поставља на ПЦР машину за амплификацију, а на крају се чип ставља у читач да очита флуоресцентни сигнал фотографисањем.Операција је компликованија.Ризик од контаминације је низак.
Параметри сваке дигиталне ПЦР платформе су сумирани на следећи начин:
Индикатори евалуације дигиталне ПЦР платформе су: број подељених јединица, број флуоресцентних канала, сложеност рада и ризик од контаминације.Али најважнија ствар је тачност детекције.Један од начина за процену дигиталних ПЦР платформи је коришћење више дигиталних ПЦР платформи за верификацију једне друге, а други начин је коришћење стандардних супстанци са тачним вредностима.
Предности дПЦР-а
1.Постизање апсолутне квантификације
2.Већа осетљивост и специфичност
3.Може да открије узорке ниске копије
Недостаци дПЦР-а1. Скупа опрема и реагенси 2. Компликована операција и дуго време детекције 3. Уски опсег детекције
Тренутно, три генерације ПЦР технологије имају своје предности и недостатке, и свака има своја поља примене, и није однос да једна генерација замењује другу.Континуирани напредак технологије убризгао је нову виталност у ПЦР технологију, омогућавајући јој да откључа један правац примене за другим, чинећи детекцију нуклеинских киселина практичнијим и прецизнијим.
Извор: Др Јуан вас води на тестирање
Препоручени производи:
Време поста: 18.11.2022
