ПЦР, вишеструки ПЦР, Ин Ситу ПЦР, Обрнути пцр, РТ-ПЦР, КПЦР (1)–ПЦР

Средићемо концепте, кораке и детаље различитих ПЦР-а

Ⅰ. ПЦР

Ланчана реакција полимеразе, позната као ПЦР, је молекуларна биолошка технологија која се користи за повећање специфичних ДНК фрагмената.Може се сматрати посебном репликацијом ДНК ин витро.ДНК полимераза (ДНК полимераза И) откривена је већ 1955. године, а Кленов фрагмент Е. цоли, који је Др Х Цоли, открио др Х. Кленов почетком 1970-их, али зато што је овај ензим не подноси температуру, тако да га висока температура не доведе у толерирану реакцију полимеразе.Ензими који се данас користе (звани КАК полимераза) су изоловани из Тхерхус Акуутицус, вруће опружне бактерије 1976. Његова карактеристика је да се може одупријети високој температури и идеалан је ензим, али се широко користи након 1980-их.Оригинални концепт првобитног примитивне прототипа ПЦР-а је сличан поправку и копирању гена, које је предложио др. Кјелл Клеппе 1971. године. Објавио је први једноставан и кратак-кратак ген копија (слично прва реакцијама ПЦР-а).ПЦР који је данас развио је данас развио др Кари Б. Муллис 1983. Др Муллис служио је ПЕ компанијама те године, тако да ПЕ има посебан статус у ПЦР индустрији.Др Муллис је званично објавио први сродни документ са Саикијем и другима 1985. године, јер је употреба ПЦР-а хиљадама километара на хиљадама километара дневно, а може се рећи да је квалитет повезаних радова да направи многе друге истраживачке методе непагалне.Након тога, ПЦР технологија се широко користи у биолошком научном истраживању и клиничким апликацијама, постајући најважнија технологија истраживања молекуларне биологије.Мулис је такође добио Нобелову награду за хемију 1993.

ПЦРПринцип

Основни принцип ПЦР технологије сличан је природним процесу репликације ДНК, а његова специфичност зависи од олигонуклеотидног темељног темељног темељног простора на оба краја циљног низа.ПЦР се састоји од дегенерације-жарућих три основне реакције корака: ①дегенерација шаблона ДНК: Након што се ДНК образац загреје на око 93 ° Ц, двоструки ДНК раствор за дна ДНК који је формирао ПЦР Амплификацију ДНК-а, што може да се комбинује са прамом да се у наредни округли реакција буде комбиновано.≥ Жнелирање (једињење) шаблона ДНК и темељни премаз: Након што се ДНК образац загреје и дегенерише у један ланац, температура пада на око 55 ° Ц.Комплементарна секвенца прајмера и шаблона ДНК једноланчана.≥ Проширење темељног темеља: ДНК предложак - везивање прајмера заснован је на дјеловању Такдне полимеразе, са ДНТП-ом као реакционим сировинама.Држите принцип репликације, синтетизовати нову посуду за копирање који употпуњава ланцу ДНК-а и поновите дегенерацију циклуса-прераспоређивање и продужење Три процеса могу добити више "Полу резервисаног ланца копирања", а овај нови ланац је поново постао предложак за следећи циклус.Потребно је 2-4 минута да се заврши петља, циљни ген се може појачати неколико милиона пута за 2-3 сата.

СтандардПЦРРеакциони систем

Пет елемената ПЦР реакције

У ПЦР реакцији је углавном укључено пет врста супстанци, а то су прајмер, ензим, дНТП, шаблон и пуфер (потребан је Мг2+).[ПЦР процедура]

Стандардни ПЦР процес је подељен у три корака

1. Дегенерација ДНК (90°Ц-96°Ц): Дволанчани ДНК шаблони под термичким дејством, водоничне везе пуцају, формирајући једноланчану ДНК.

2. Жарење (25℃ -65℃): Температура система се смањује, прајмер се комбинује са ДНК шаблоном да би се формирао локални двоструки ланац.

3. Проширење (70 ℃ -75 ℃): Под акцијом Ензима ТАК-а (око 72 ° Ц, ДНТП се користи као сировина, проширује се од 5 "Крај темељника → 3" Крај, синтеза и шаблона употпуњују се сваки други ланца ДНК.

Сваки циклус се денатурише, жари и продужава, удвостручујући садржај ДНК.Тренутно, због кратког подручја амплификације, неки ПЦР се може поновити у врло кратком року, чак и ако активност Ензимска акција није оптимална, тако да се може променити у два корака, односно, а да се гоњење и продужење и истовремено може извести на 60 ° Ц-65 ° Ц истовремено.У циљу смањења процеса подизања и хлађења и побољшања брзине одзива.

Карактеристике ПЦР реакције

● Висока специфичност

Специфични одлучујући фактори ПЦР одговора су: ①Специфична комбинација прајмера и ДНК шаблона.②Принцип упаривања база.③Лојалност реакције синтезе ТакДНК полимеразе.④Специфичност и конзервативност циљног гена.

Исправна комбинација прајмера и шаблона је кључ.Везивање прајмера и шаблона и продужетак ланца прајмера заснива се на принципу подударности алкалних база.Лојалност реакција синтезе полимеразе и отпорност на високе температуре Так ДНК полимеразе да би се направило везивање (једињење) шаблона и прајмера у реакцији може се извести на вишој температури.Специфичност комбинације је знатно повећана.Клип може одржати висок степен исправности.Одабиром циљног генетског региона са високом конзервативношћу и високом конзервативношћу, његова специфичност је већа.

● Висока осетљивост

Обим производње ПЦР производа се повећава за индекс, који може проширити почетни шаблон Пицкер-а (ПГ=10-12) да би се ниво микроконтролера повећао на ниво микрограма (μг= -6).Циљне ћелије се могу открити од милион ћелија;У откривању вируса, осетљивост ПЦР-а може достићи 3 рфус (празне спотове формиране јединице);Минимална стопа откривања у бактеријској науци је 3 бактерије.

● Једноставно и брзо

Оффлекција ПЦР користи високу температуру ДНК полимеразу, која у једном тренутку додаје реакциони раствор, односно реакцију дегенерације-аннеалне продужења на раствор за појачавање ДНК и лонац за водене купељи.Генерално, реакција амплификације се завршава за 2 до 4 сата.Проширени производи се генерално анализирају електричним мачем и не морају да користе изотопе, без радиоактивног загађења и лаку промоцију.

● Чистоћа узорка је ниска

Нема потребе да се одвајају вируси или ћелије бактерија и културе.ДНК Цруде производи и РНА могу се користити као појачала.Детекција ДНК амплификације се може користити директно коришћењем клиничких узорака као што су крв, телесна течност, течност за прање кашља, коса, ћелије и живо ткиво.

ПЦРуобичајени проблеми

● Лажно негативно, нема појачаних бендова

Кључне фазе ПЦР реакције укључују: ① Припрема нуклеинских киселина предложака, ② Квалитет и специфичност прајмера, ③ Квалитет ензима ④ услови циклуса ПЦР.Проналажење разлога такође треба анализирати и проучити за горње везе.

Шаблони: ① Шаблон садржи разне протеине, ② Шаблон садржи инхибитор ензима Так, ③ Протеин у шаблону се не елиминише, посебно протеин групе у хромозому.⑤ Деминерска дегенерација нуклеинске киселине није темељна.Када је квалитет ензима и прајмера добар, нема траке за појачавање, што је највероватније дигестивни третман узорака.Нешто није у реду са процесом екстракције шаблонске нуклеинске киселине, тако да за припрему ефикасног и стабилног раствора за варење, његову процедуру треба фиксирати, а не произвољно мењати.

Инактивација ензима: нови ензим или и стари и нови ензими треба да се користе заједно да се анализира да ли је активност ензима изгубљена или недовољна, што доводи до лажних негативних резултата.Треба напоменути да се Так ензим или етидијум бромид понекад заборавља.

Прајмер: квалитет прајмера, концентрација прајмера и да ли је концентрација два прајмера симетрична.То је чест разлог за неуспех ПЦР-а или растући појас није идеалан и склон дифузији.Постоје проблеми са квалитетом прајмера неких серија.Два прајмера имају високу концентрацију и ниску концентрацију, узрокујући ниску ефикасност асиметричне амплификације.Противмере су: ① Изаберите добар прајмер за синтезу јединица.② Концентрација прајмера не зависи само од вредности ОД, већ такође обраћа пажњу на оригиналну течност прајмера да би се направила електрофореза у агар шећерном гелу.Мора постојати зона траке прајмера, а сјај два прајмера треба да буде генерално конзистентан.Појас, ПЦР у овом тренутку може да не успе и то треба да се реши помоћу јединице за синтезу прајмера.Ако је прајмер висок, осветљеност је мала, а његова концентрација мора бити уравнотежена када се разблажи.③ Прајмер треба платити и чувати у високој концентрацији како би се спречило вишеструко смрзавање или дуготрајно хлађење делова фрижидера, што ће проузроковати пропадање и деградацију прајмера.④ Дизајн прајмера је неразуман, као што је дужина прајмера недовољна, а ди кластер се формира између прајмера.

Концентрација Мг2+: Концентрација Мг2+јона има велики утицај на ефикасност ПЦР амплификације.Прекомерна концентрација може смањити ПЦР амплификацију супротног пола.Ако је концентрација прениска, излаз ПЦР амплификације ће чак довести до неуспеха ПЦР амплификације без експанзионе траке.

Промена запремине реакције: Запремина која се користи у ПЦР амплификацији је 20ул, 30ул, и 50ул или 100уЛ, велики обим апликације за ПЦР амплификацију је подешен према различитим сврхама научног истраживања и клиничког тестирања.Након што направите мале количине као што је 20ул, потребно је да направите услов за кабл приликом израде величине, иначе ће пропасти.

Физички разлози: Трансформација је веома важна за АМПЛИФИКАЦИЈА ПЦР-а.Ако је температура дегенерације ниска, време дегенерације је кратко, вероватно ће се појавити у лажним негативима;Претезана температура жарући може проузроковати не -специфично појачање и смањити специфичну ефикасност појачања.Високо утиче на комбинацију прајмера и шаблона за смањење ефикасности амплификације ПЦР-а.Понекад је потребно користити стандардне термометре за детекцију варијабилности, жарења и продужене температуре у продужетку или шпорету растворљивом у води, што је један од разлога неисправности ПЦР-а.

Варијанте циљне секвенце: Ако дође до циљне секвенце, до мутације или делеције, комбинације прототипа и шаблона се комбинује, или због недостатка циљне секвенце, прајмер и шаблон ће изгубити комплементарну секвенцу, а њена ПЦР амплификација неће бити успешна.

● Лажно позитиван

Банд за ПЦР појачало се у складу са циљаним редоследом, а понекад је њен опсег уреднији и већи.

Дизајн прајмера није прикладан: изабрана секвенца амплификације и ненаменска амплификациона секвенца су хомологне, па када ПЦР амплификација, амплификовани ПЦР производи су ненаменске секвенце.Циљни низ је прекратак или је прајмер прекратак и склони су лажним позитивним.Треба редизајнирати.

Унакрсно загађење циљне секвенце или продуката амплификације: Постоје два разлога за ово загађење: Прво, унакрсно загађење целог генома или великих сегмената, што доводи до лажних позитивних резултата.Ова врста лажно позитивних може се решити следећим методама: Будите пажљиви и нежни током рада како бисте спречили да циљна секвенца удахне у пиштољ за узорак или да прска из центрифугалне цеви.Осим ензима и супстанци које не могу да издрже високе температуре, све реагенсе или опрему треба дезинфиковати високим притиском.Центрифугалне цеви и узорке треба користити истовремено.Када је потребно, пре додавања узорака, реакциона епрувета и реагенс се излажу ултраљубичастим зрацима како би се уништила постојећа нуклеинска киселина.Друго, мали фрагменти у загађењу ваздуха.Ови мали фрагменти су краћи од циљне секвенце, али имају одређену хомологију.Може се спојити један са другим.Након допуне прајмера, ПЦР производ се може проширити, што ће изазвати лажно позитивну производњу.Може се користити за смањење или уклањање гнезда ПЦР методе.

● Појављују се неспецифични опсег појачања

Траке које су се појавиле након ПЦР амплификације нису у складу са очекиваном величином, или велике или мале, или у исто време, или у исто време, специфичне амплификационе траке и неспецифичне амплификације.Појава неспецифичних трака је: Прво, прајмери ​​су некомплетни комплементарни циљној секвенци, или полимеризација прајмера да би се формирао ди кластер.Други је да је концентрација МГ2+ јона превисока, температура жарења прениска, а број ПЦР циклуса је повезан.Друго, квалитет и количина ензима.Често су ензими неких извора склони неспецијалним тракама, а ензими другог извора се не појављују.Понекад се јавља и неспецифична амплификација ензима.Противмере су: редизајн атрактивности ако је потребно.Смањите количину ензима или замените ензим другог извора.Смањите количину примарних, повећајте количину шаблона на одговарајући начин и смањите број циклуса.Правилно повећајте температуру жарења или користите методу две температурне тачке (дегенерација од 93°Ц, жарење и проширење на око 65°Ц).

● Појави се љускава вуча или размазана трака

Понекад се појављује ПЦР појачало се наноси или гранатира или гранатира или на каишем налик тепиху.Из разлога, због превелике количине ензима или лошег квалитета ензима, концентрација дНТП је превисока, концентрација Мг2+ је превисока, температура жарења је прениска, а број циклуса је превелик.Противмере су: ≥Редуце количина ензима или промени ензиму другог извора.②Смањите концентрацију дНТП ③Прописно смањите концентрацију Мг2+.④Повећајте количину шаблона и смањите број циклуса.

Повезани производи

ПЦР Хероᵀᴹ (са бојом)

◮ Већа верност: 6 пута у обичном Ензиму КАК-а;

◮ Већа брзина појачања

◮ Више прилагодљивости шаблона

◮ Већа ефикасност појачања

◮ Толеранција на животну средину је јача: постављена на 37 ° Ц недељно, одржавајући више од 90% активности;

◮ Има 5 '→ 3' ДНК активност полимеразе и 5 '→ 3' активност егзонуклеасе, без 3 '→ 5' активности егзонуклеасе.

ПЦР Еасиᵀᴹ (са бојом)

Јединствени реакциони систем и високоефикасна Так ДНК полимераза чине да ПЦР реакција има већу ефикасност амплификације, специфичност и осетљивост.

РТ-qПЦР Еасиᵀᴹ (Оне Степ)-СИБР Греен И

◮ Комплет у једном кораку чини реверзну транскрипцију и кПЦР две реакције у истој епрувети, потребно је само додати шаблон РНК, специфичне ПЦР прајмере и ддХ без РНазе₂O.

◮ Комплет може брзо и ефикасно квантитативно анализирати вирусну РНК или РНК у траговима.

◮ Комплет користи јединствени Форегене реагенс реверзне транскрипције и Форегене ХотСтар Так ДНК полимеразу у комбинацији са јединственим реакционим системом за ефикасно побољшање ефикасности амплификације и специфичности реакције.

◮ Оптимизовани реакциони систем чини да реакција има већу осетљивост детекције, јачу термичку стабилност и бољу толеранцију.

◮ РТ-кПЦР Лако^TM(Оне Степ)-СИБР Греен И комплет долази са РОКС интерном референтном бојом, која се може користити да елиминише позадину сигнала и грешке сигнала између бунара, што је згодно за кориснике да користе у различитим моделима квантитативних ПЦР инструмената.

РТ Еаси^TMИИ (Мастер премикс за синтеза првог ланца цДНК заПЦР у реалном времену)

-Ефикасна способност уклањања гДНК, која може уклонити гДНК у шаблону у року од 2 минута.

- Ефикасан систем реверзне транскрипције, потребно је само 15 минута да се заврши синтеза првог ланца цДНК.

-Сложени шаблони: шаблони са високим садржајем ГЦ и сложеном секундарном структуром се такође могу обрнути са великом ефикасношћу.

- Високоосетљиви систем реверзне транскрипције, шаблони на нивоу пг такође могу да добију висококвалитетну цДНК.

-Систем реверзне транскрипције има високу термичку стабилност, оптимална температура реакције је 42 ℃, а и даље има добре перформансе реверзне транскрипције на 50 ℃.