ПЦР (ланчана реакција полимеразе) је једна од технологија ин-витро амплификације ДНК, са историјом дужом од 30 година.

ПЦР технологију је пионир Кари Муллис из Цетуса, САД 1983. Муллис се пријавио за ПЦР патент 1985. и објавио први ПЦР академски рад о науци исте године.Мулис је за свој рад добио Нобелову награду за хемију 1993. године.

Основни принципи ПЦР-а

ПЦР може да појача фрагменте циљне ДНК више од милион пута.Принцип је под катализом ДНК полимеразе, користећи ДНК родитељског ланца као шаблон и специфичан прајмер као почетну тачку за продужавање.Реплицира се ин витро кроз кораке као што су денатурација, жарење и екстензија.Процес ћерки ланца ДНК комплементаран матичном ланцу шаблон ДНК.

Стандардни ПЦР процес је подељен у три корака:

1. Денатурација: Користите високу температуру да бисте одвојили двоструке ланце ДНК.Водоничка веза између двоструких ланаца ДНК се прекида на високој температури (93-98 ℃).

2. Жарење: Након што је дволанчана ДНК одвојена, снизите температуру тако да се прајмер може везати за једноланчану ДНК.

3. Продужетак: ДНК полимераза почиње да синтетише комплементарне ланце дуж ланаца ДНК од везаних прајмера када се температура спусти.Када је проширење завршено, циклус је завршен, а број фрагмената ДНК се удвостручује

Узвраћањем ова три корака 25-35 пута, број фрагмената ДНК ће се експоненцијално повећати.

Генијалност ПЦР-а је у томе што се различити прајмери ​​могу дизајнирати за различите циљне гене, тако да се фрагменти циљног гена могу појачати у кратком временском периоду.

До сада се ПЦР може поделити у три категорије, а то су обични ПЦР, флуоресцентни квантитативни ПЦР и дигитални ПЦР.

Прва генерација обичног ПЦР-а

Користите обичан инструмент за ПЦР амплификацију да појачате циљни ген, а затим користите електрофорезу у агарозном гелу за детекцију производа, може се урадити само квалитативна анализа.

Главни недостаци ПЦР прве генерације:

1. Склон неспецифичном појачавању и лажно позитивним резултатима.

2. Откривање траје дуго и операција је гломазна.

3. Може се урадити само квалитативни тест

ПЦР у реалном времену друге генерације

ПЦР у реалном времену, такође познат као кПЦР, користи флуоресцентне сонде које могу да укажу на напредак реакционог система и прати акумулацију појачаних продуката кроз акумулацију флуоресцентних сигнала и процењује резултате кроз криву флуоресценције.Може се квантификовати уз помоћ вредности Цк и стандардне криве.

Пошто се кПЦР технологија спроводи у затвореном систему, вероватноћа контаминације је смањена, а сигнал флуоресценције се може пратити за квантитативну детекцију, тако да је најшире коришћена у клиничкој пракси и постала је доминантна технологија у ПЦР-у.

Флуоресцентне супстанце које се користе у флуоресцентном квантитативном ПЦР-у у реалном времену могу се поделити на: ТакМан флуоресцентну сонду, молекуларне светионике и флуоресцентну боју.

1) ТакМан флуоресцентна сонда:

Током ПЦР амплификације, специфична флуоресцентна сонда се додаје уз додавање пара прајмера.Сонда је олигонуклеотид, а оба краја су обележена репортерском флуоресцентном групом и флуоресцентном групом за гашење.

Када је сонда нетакнута, флуоресцентни сигнал који емитује репортерска група апсорбује група за гашење;током ПЦР амплификације, 5′-3′ егзонуклеазна активност ензима Так цепа и деградира сонду, чинећи репортерску флуоресцентну групу и гаситељ. Флуоресцентна група је одвојена, тако да систем за праћење флуоресценције може да прими сигнал флуоресценције, то јест, сваки пут када се формира флуоресцентни ланац флуоресцентне ДНК и формира се молекул флуоресценције флуоресценције. сценски сигнал је потпуно синхронизован са формирањем ПЦР производа.

2) СИБР флуоресцентна боја:

У ПЦР реакционом систему се додаје вишак СИБР флуоресцентне боје.Након што је СИБР флуоресцентна боја неспецифично уграђена у двоструки ланац ДНК, емитује флуоресцентни сигнал.Молекул СИБР боје који није уграђен у ланац неће емитовати никакав флуоресцентни сигнал, чиме се обезбеђује флуоресцентни сигнал. Повећање ПЦР производа је потпуно синхронизовано са повећањем ПЦР производа.СИБР се везује само за дволанчану ДНК, тако да се крива топљења може користити да се утврди да ли је ПЦР реакција специфична.

3) Молекуларни светионик:

То је двоструко обележена олигонуклеотидна сонда у облику петље која формира структуру укоснице од око 8 база на 5 и 3 краја.Секвенце нуклеинске киселине на оба краја су комплементарно упарене, што узрокује да су флуоресцентна група и група за гашење тесне.Затвори, неће се производити флуоресценција.

Након што се ПЦР производ генерише, током процеса жарења, средњи део молекуларног сигнала се упарује са специфичном секвенцом ДНК, а флуоресцентни ген се одваја од гена за гашење да би се произвела флуоресценција.

Главни недостаци ПЦР друге генерације:

Осетљивост још увек недостаје, а детекција примерака са мало копије је нетачна.

Постоји утицај позадинске вредности, а резултат је подложан сметњама.

Када у реакционом систему постоје ПЦР инхибитори, резултати детекције су подложни сметњама.

Дигитални ПЦР треће генерације

Дигитални ПЦР (ДигиталПЦР, дПЦР, Диг-ПЦР) израчунава број копија циљне секвенце кроз детекцију крајње тачке и може да изврши тачну апсолутну квантитативну детекцију без употребе интерних контрола и стандардних кривих.

Дигитални ПЦР користи детекцију крајње тачке и не зависи од вредности Цт (праг циклуса), тако да на дигиталну ПЦР реакцију мање утиче ефикасност амплификације, а толеранција на инхибиторе ПЦР реакције је побољшана, са високом прецизношћу и репродуктивношћу.

Због карактеристика високе осетљивости и високе тачности, инхибитори ПЦР реакције га не ометају лако, а може постићи праву апсолутну квантификацију без стандардних производа, што је постало жариште истраживања и примене.

Према различитим облицима реакционе јединице, може се поделити на три главна типа: микрофлуидни, чип и системи капљица.

1) Микрофлуидни дигитални ПЦР, мдПЦР:

На основу микрофлуидне технологије, ДНК шаблон је одвојен.Микрофлуидна технологија може да реализује нано-надоградњу узорка или стварање мањих капљица, али капљицама је потребна посебна метода адсорпције и затим комбинована са ПЦР реакционим системом.мдПЦР је постепено усвајан другим методама замене.

2) Дигитални ПЦР заснован на капљицама, ддПЦР:

Користите технологију генерисања капљица воде у уљу да обрадите узорак у капљице и поделите реакциони систем који садржи молекуле нуклеинске киселине на хиљаде капљица наноразмера, од којих свака не садржи циљни молекул нуклеинске киселине који треба да се детектује, или садржи један до неколико циљних молекула нуклеинске киселине за тестирање.

3) Дигитални ПЦР базиран на чипу, цдПЦР:

Користите интегрисану технологију путања флуида за гравирање многих микроепрувета и микрошупљина на силиконским плочицама или кварцном стаклу и контролишете проток раствора кроз различите контролне вентиле и поделите течност узорка на нанометре исте величине у реакционе бунаре за дигиталну ПЦР реакцију да бисте постигли апсолутну квантификацију.

Главни недостаци ПЦР треће генерације:

Опрема и реагенси су скупи.

Захтеви за квалитет шаблона су високи.Ако количина шаблона премашује количину микросистема, биће немогуће квантификовати, а ако је премала, тачност квантификације ће бити смањена.

Лажни позитивни резултати се такође могу генерисати када постоји неспецифично појачање.