ЦОВИД-19 је заразна болест узрокована тешким акутним респираторним синдромом коронавирусом типа 2. Када је особа заражена, најчешћи симптоми су грозница, кашаљ и кратак дах.

Узорци који се користе за тестирање могу се узети брисевима назофаринкса или орофарингеалних брисева.

Шта је ПЦР?

Стандардни метод детекције коронавируса је полимеразна ланчана реакција, ПЦР.Ово је метода која се широко користи у молекуларној биологији.Може брзо да копира милионе до милијарде специфичних фрагмената ДНК.

Нови коронавирус садржи веома дугачак једноланчани РНК геном.Да би се ови вируси открили ПЦР-ом, РНК молекули морају бити конвертовани у њихове комплементарне ДНК секвенце помоћу реверзне транскриптазе, а затим се новосинтетизована ДНК може амплифицирати стандардним ПЦР процедурама, што је обично познато као РТ-ПЦР.

РТ-ПЦР процес

Екстракција РНК

Да би се извршила ова метода, вирусна РНК у основи треба да се екстрахује.Различити комплети за пречишћавање РНК могу се користити за практично, брзо и ефикасно одвајање.

Да бисте екстраховали вирусну РНК помоћу комерцијалног комплета, прво додајте узорак у епрувету за микроцентрифугу, а затим га помешајте са пуфером за лизу.Овај пуфер је високо денатурисан и обично се састоји од фенола и гванидин изотиоцијаната.Поред тога, инхибитори РНазе су обично присутни у пуферу за лизу да би се обезбедила изолација интактне вирусне РНК.

Након додавања пуфера за лизу, вортексирајте епрувету за мешање пулсом и инкубирајте на собној температури.Вирус се затим лизира у условима високе денатурације које обезбеђује пуфер за лизу.

Након што се узорак лизира, за поступак пречишћавања се користи епрувета за центрифугу.Узорак се ставља у епрувету за центрифугирање и затим центрифугира.

Овај поступак је метода екстракције чврсте фазе у којој се стационарна фаза састоји од матрице силика гела.

Под оптималним условима соли и пХ, молекули РНК се везују за силицијумску мембрану.

Истовремено се уклањају протеини и други загађивачи.

Након центрифугирања, ставите епрувету за центрифугирање у чисту епрувету за сакупљање, баците филтрат, а затим додајте пуфер за прање.

Поново ставите епрувету у центрифугу да прогура пуфер за испирање кроз мембрану.Ово ће уклонити све преостале нечистоће са мембране, остављајући само РНК везану за силика гел.

Након што је узорак испран, ставите епрувету у чисту епрувету за микроцентрифугу и додајте пуфер за елуирање.

Затим се центрифугира да би се пуфер за елуирање прогурао кроз мембрану.Пуфер за елуирање уклања вирусну РНК из спин колоне и добија пречишћену РНК без протеина, инхибитора и других контаминаната.

КОРАК 2

Мешани концентрат

Након екстракције вирусне РНК, следећи корак је припрема реакционе смеше за ПЦР амплификацију.У овом кораку се користи концентрат.Овај концентровани раствор је унапред мешани концентровани раствор који се састоји од премикса, реверзне транскриптазе, нуклеотида, предњег прајмера, реверзног прајмера, ТакМан сонде и ДНК полимеразе.

На крају, да би се завршила ова реакциона смеша, додат је РНК шаблон.Епрувете се мешају пулсним вортексом, а затим се реакциона смеша ставља у ПЦР плочу.ПЦР плоча обично садржи 96 јажица и може анализирати више узорака истовремено.

КОРАК 3

ПЦР амплификација

Затим ставите плочу у ПЦР машину, која је у суштини термални циклус.

РТ-ПЦР у реалном времену се користи за откривање новог коронавируса из 2019. амплификацијом циљне секвенце у гену РдрРП, гену Е и Н гену.Избор циљног гена зависи од секвенце прајмера и сонде.

Први корак РТ-ПЦР-а је реверзна транскрипција.Синтетише се први ланац комплементарне ДНК, који се покреће ПЦР реверзним прајмером, који се везује за комплементарни део генома вирусне РНК.Затим реверзна транскриптаза додаје нуклеотиде ДНК на 3′крај прајмера да би се синтетизовала ДНК комплементарна вирусној РНК.Температура и трајање овог корака зависе од коришћених прајмера, циљне РНК и реверзне транскриптазе.

Затим се примењује почетни корак денатурације, који резултира денатурацијом РНА-ДНК хибрида.Овај корак је неопходан да би се активирала ДНК полимераза.Истовремено, реверзна транскриптаза је инактивирана.

ПЦР се састоји од серије термичких циклуса.Сваки циклус се састоји од корака денатурације, жарења и проширења.

Корак денатурације укључује загревање реакционе коморе на 95 степени Целзијуса и њено коришћење за денатурацију дволанчаног ДНК шаблона.

У следећем кораку, реакциона температура је смањена на 58 степени Целзијуса, омогућавајући предњем прајмеру да се жари у комплементарном делу свог једноланчаног ДНК шаблона.Температура жарења директно зависи од дужине и састава прајмера.

У кораку проширења, ДНК полимераза синтетише нови ланац ДНК који је комплементаран ланцу ДНК шаблона.Додавањем слободних језгара комплементарних шаблону у правцу од 5′ до 3′ из реакционе смеше.Температура овог корака зависи од коришћене ДНК полимеразе.

После првог циклуса добија се дволанчана ДНК мета.

Затим уђите у други циклус.Дволанчана ДНК се денатурира да би се произвела два једноланчана ДНК молекула.

У следећем кораку, реакциона температура се снижава, прајмери ​​се жаре са сваким једноланчаним ДНК шаблоном, а Так-ман сонда се жари са комплементарним делом циљне ДНК.

ТакМан сонда се састоји од флуорофора који је ковалентно повезан са 5′-крајем олигонуклеотидне сонде.Када је узбуђен извором светлости циклуса, флуорофор емитује флуоресценцију.Поред тога, сонда је састављена од гашења на 3′крају.Близина репортерског гена гаситељу спречава детекцију флуоресценције.

У кораку екстензије, ДНК полимераза синтетише нови ланац.Када полимераза стигне до ТакМан сонде, њена ендогена активност 5'нуклеазе цепа сонду, одвајајући боју од гаса.

Са сваким циклусом ПЦР-а, ослобађа се више молекула боје, што резултира повећањем интензитета флуоресценције пропорционално броју синтетизованих ампликона.

Овај метод омогућава да се процени број дате секвенце присутне у узорку.Број фрагмената дволанчаних ДНК се удвостручује у сваком циклусу.Због тога се ПЦР може користити за анализу веома малих узорака.

За мерење флуоресцентног сигнала, волфрамове халогене лампе, ексцитационог филтера, рефлектора, сочива, емисионог филтера и уређаја са наелектрисањем користите ЦЦД камеру.

КОРАК 4 Откријте

За мерење флуоресцентног сигнала, волфрамове халогене лампе, ексцитационог филтера, рефлектора, сочива, емисионог филтера и уређаја са наелектрисањем користите ЦЦД камеру.

Филтрирана светлост лампе се рефлектује од рефлектора, пролази кроз кондензаторско сочиво и фокусира се на центар сваке рупе.Затим се флуоресценција која се емитује из рупе рефлектује од огледала, пролази кроз емисиони филтер и детектује је ЦЦД камера.У сваком ПЦР циклусу, самопобуђена светлост флуорофора може се детектовати помоћу ЦЦД-а.

Конвертује ухваћено светло у дигиталне податке.Овај метод се назива ПЦР у реалном времену и омогућава праћење тока ПЦР реакције у реалном времену.