Ⅰ. Повећајте осетљивост реакционог система:

1. Одвојите РНК високог квалитета:

Успешна синтеза цДНК долази од висококвалитетне РНК.Висококвалитетна РНК треба да обезбеди најмање укупно дуже и да не садржи инхибиторе који не садрже ензиме за снимање, као што су ЕДТА или СДС.Квалитет РНК одређује максималну вредност информација о секвенци које можете транскрибовати у цДНК.Општи метод пречишћавања РНК је корак метода коришћења изооцијаната/ацидофенола.Да би се спречило загађење РНК-азе, РНК одвојена од узорка богатог РНК-азом (као што је панкреас) захтева складиштење формалдехида да би се сачувала висококвалитетна РНК, што је још важније за дуготрајно складиштење.РНК екстрахована из јетре пацова се у основи разградила након једне недеље складиштења у води, док је РНК екстрахована из слезине пацова остала стабилна након три године складиштења у води.Поред тога, транскрипти већи од 4 кб су осетљивији на деградацију РНасе у траговима од малих транскрипта.Да би се повећала стабилност узорка РНК за складиштење, РНК се може растворити у металмамину јона и чувати на -70 °Ц.Тилид који се користи за чување РНК не сме да садржи разне предмете који разграђују РНК.РНК, која се добија из панкреаса, може се чувати у металмамину најмање годину дана.Када будете спремни да користите РНК, можете користити следеће методе за таложење РНК: додајте НаЦл у 0,2м и 4 пута већу запремину етанола, ставите на собну температуру 3-5 минута и 10.000 × г центрифугирајте 5 минута.

2. Користите реверзну транскриптазу без активности РНасеХ (РНасеХ-):

Инхибитори РНазе се често додају реакцијама реверзне транскрипције да би се повећала дужина и принос синтезе цДНК.Инхибитор РНазе се додаје у реакцији прве ланчане синтезе у присуству пуфера и редукционих агенаса као што је ДТТ јер процес синтезе пре-цДНК денатурира инхибитор, чиме се ослобађају везане РНКазе које разграђују РНК.Инхибитор протеинске РНКазе само спречава разградњу РНК од стране РНКазе А, Б, Ц, и не спречава РНазе на кожи, тако да треба водити рачуна да се РНазе не уносе из прстију упркос употреби ових инхибитора.

Реверзна транскриптаза катализује конверзију РНК у цДНК.И М-МЛВ и АМВ имају ендогену активност РНасеХ поред сопствене активности полимеразе.Активност РНасеХ се такмичи са активношћу полимеразе за хетерозиготне ланце формиране између РНК шаблона и ДНК прајмера или цДНК продужетних ланаца, и разграђује РНК: РНК ланце у ДНК комплексима.РНК шаблони деградирани активношћу РНасеХ не могу се више користити као ефикасни супстрати за синтезу цДНК, смањујући принос и дужину синтезе цДНК.Тако би елиминисање или значајно смањење РНасеХ активности реверзне транскриптазе било од велике користи.

СуперСцриптⅡ реверзна транскриптаза, ММЛВ реверзна транскриптаза РНасеХ- и тхермоСцрипт реверзна транскриптаза, АМВ РНасеХ- дале су више цДНК пуне дужине него ММЛВ и АМВ.На осетљивост РТ-ПЦР утиче количина синтетизоване цДНК.ТхермоСцрипт је много осетљивији од АМВ-а.Величина РТ-ПЦР производа је ограничена способношћу реверзне транскриптазе да синтетише цДНК, посебно када се клонирају веће Цднас.У поређењу са ММЛВ, СуперСцрипⅡ је значајно повећао принос дугих РТ-ПЦР производа.Реверзна транскриптаза РНасеХ-а такође повећава термичку стабилност, тако да се реакција може извести на температурама вишим од нормалних од 37-42℃.У предложеним условима синтезе, коришћени су олиго(дТ) прајмери ​​и 10μЦи [алфа-п]дЦТП.Укупна производња првог ланца израчуната је применом ТЦА методе преципитације.цДНК пуне дужине је анализирана коришћењем уклањања трака сортираних по величини и бројања у алкалном агарозном гелу.

3. Повећајте температуру очувања топлоте реверзне транскрипције:

Виша температура задржавања помаже да се отвори секундарна структура РНК и повећа принос реакције.За већину РНК шаблона, држање РНК и прајмера на 65°Ц без пуфера или соли, а затим њихово брзо хлађење на леду елиминише већину секундарних структура и омогућава прајмерима да се вежу.Међутим, неки шаблони и даље имају секундарну структуру, чак и након термичке денатурације.Амплификација ових тешких шаблона може се извести коришћењем ТхермоСцрипт реверзне транскриптазе и постављањем реакције реверзне транскриптазе на више температуре да би се побољшала амплификација.Више температуре држања такође могу повећати специфичност, посебно када се синтеза цДНК изводи коришћењем ген-специфичних прајмера (ГСПС) (видети Поглавље 3).Ако користите ГСП, уверите се да је вредност Тм прајмера иста као и очекивана температура задржавања.Немојте користити олиго(дТ) и насумичне прајмере изнад 60℃.Случајне прајмере треба држати на 25 ℃ 10 минута пре него што се повећа на 60 ℃.Поред коришћења виших температура реверзне транскрипције, специфичност се може побољшати директним преношењем мешавине РНК/прајмера са температуре денатурације од 65℃ на температуру задржавања реверзне транскрипције и додавањем претходно загрејане 2× реакционе смеше (цДНК термална иницијална синтеза).Овај приступ помаже у спречавању интермолекуларног упаривања база које се јавља на нижим температурама.Коришћење ПЦР инструмента поједностављује многе температурне прекидаче потребне за РТ-ПЦР.

Ттх топлотно стабилизована полимераза делује као ДНК полимераза у присуству Мг2+ и РНК полимераза у присуству Мн2+.Може задржати топлоту до 65 ℃.Међутим, присуство Мн2+ током ПЦР-а смањује верност, што чини Ттх полимеразу мање погодном за амплификацију високе прецизности, као што је клонирање цДНК.Поред тога, Ттх је мање ефикасан у реверзној транскрипцији, што смањује осетљивост, а пошто један ензим може да изврши реверзну транскрипцију и ПЦР, контролне реакције без реверзне транскрипције не могу се користити за разликовање амплификованих производа цДНК од оних контаминиране геномске ДНК.

4. Адитив који промовише обрнуту транскрипцију:

Додавање адитива, укључујући глицерин и ДМСО, у прву реакцију ланчане синтезе може смањити стабилност двоструког ланца нуклеинске киселине и одмотати секундарну структуру РНК.Може се додати до 20% глицерина или 10% ДМСО без утицаја на активност СуперСцриптⅡ или ММЛВ.АМВ такође може толерисати до 20% глицерола без смањења активности.Да би се максимизирала осетљивост РТ-ПЦР у реакцији реверзне транскрипције СуперСцриптⅡ, може се додати 10% глицерола и изоловати на 45℃.Ако се 1/10 производа реакције ретротранскрипције дода у ПЦР, концентрација глицерола у реакцији амплификације је 0,4%, што није довољно да инхибира ПЦР.

5. РНасеХ обрада:

Осетљивост се може побољшати третирањем реакција синтезе цДНК са РНасеХ пре ПЦР-а.За неке шаблоне, сматра се да РНК у реакцији синтезе цДНК спречава везивање амплификованих производа, у ком случају третман РНасеХ може повећати осетљивост.Генерално, третман РНасеХ је неопходан за амплификацију релативно дугог цДНК циљног шаблона пуне дужине, као што је туберозна шерозаⅡ са ниском копијом.За овај тежак шаблон, РНасеХ је побољшао сигнал генерисан од цДНК синтетизоване СуперСцриптⅡ или АМВ.За већину РТ-ПЦР реакција, третман РНасеХ је опциони јер корак денатурације ПЦР-а на 95℃ изоловано обично хидролизује РНК из комплекса РНК:ДНК.

6. Побољшане методе за откривање малих количина РНК:

РТ-ПЦР је посебно изазован када су доступне само мале количине РНК.Додавање гликогена као носача током раздвајања РНК помаже да се повећа принос малих узорака.Гликоген без РНазе се може додати истовремено са Тризолом.Гликоген је растворљив у води и може остати у воденој фази са РНК да би помогао у каснијим преципитацијама.Препоручена концентрација гликогена без РНазе је 250 μг/мл за узорке мање од 50 мг ткива или 106 култивисаних ћелија.

Додавање ацетилираног БСА реакцијама реверзне транскрипције помоћу СуперСцриптⅡ може повећати осетљивост, а за мале количине РНК смањење количине СуперСцриптⅡ и додавање 40 јединица инхибитора нуклеазе РнасеОут може побољшати ниво детекције.Ако се гликоген користи за раздвајање РНК, и даље се препоручује додавање инхибитора БСА или РНКазе за реверзне транскрипционе реакције помоћу СуперСцриптⅡ.

Ⅱ. Повећајте специфичност РТ-ПЦР

1. цНДА синтеза:

Три различите методе се могу користити за покретање синтезе првог ланца цДНК, а релативна специфичност сваке методе утиче на количину и тип синтетизоване цДНК.

Метода случајног прајмера је најмање специфична од три методе.Прајмери ​​се жаре на више места у целом транскрипту да би се произвела кратка цДНК делимичне дужине.Овај метод се често користи за добијање 5′ терминалних секвенци и цДНК из РНК шаблона са секундарним структурним регионима или са терминационим местима која реверзна транскриптаза не може да се реплицира.Да би се добила најдужа цДНК, однос прајмера и РНК у сваком узорку РНК треба да се одреди емпиријски.Почетна концентрација насумичних прајмера креће се од 50 до 250 нг по реакционом систему од 20 μл.Пошто је цДНК синтетизована из укупне РНК коришћењем насумичних прајмера углавном рибозомална РНК, поли(А)+РНА се генерално бира као шаблон.

Олиго(дТ) иницијација је специфичнија од насумичних прајмера.Хибридизује се са поли(А) репом који се налази на 3′ крају мРНК у већини еукариотских ћелија.Пошто поли(А)+РНА чини отприлике 1% до 2% укупне РНК, количина и сложеност цДНК је много мања него да су коришћени насумични прајмери.Због своје високе специфичности, олиго(дТ) генерално не захтева оптимизацију за однос РНК према прајмеру и поли(А)+ селекцију.Препоручује се употреба 0,5 μг олиго(дТ) по 20 μл реакционог система.олиго(дТ)12-18 је погодан за већину РТ-ПЦР.ТхермоСцрипт РТ-ПЦР систем обезбеђује олиго(дТ)20 због своје добре термичке стабилности и погодан је за више температуре држања.

Гене-специфични прајмери ​​(ГСП) су најбољи специфични прајмери ​​за корак реверзне транскрипције.ГСП је антисенс олигонуклеозид који може специфично да се хибридизује са секвенцама одредишта РНК, уместо да жари све РНК попут насумичних прајмера или олиго(дТ).Правила која се користе за дизајнирање ПЦР прајмера примењују се и на дизајн ГСП реакције реверзне транскрипције.ГСП може бити иста секвенца као прајмер за амплификацију који је жарен на крају мРНА3′, или ГСП може бити дизајниран да се жари низводно са прајмером за реверзно амплификацију.За неке амплификоване објекте, неопходно је дизајнирати више од једног антисенс прајмера за успешан РТ-ПЦР јер секундарна структура циљне РНК може спречити везивање прајмера.Предлаже се употреба 1пмол антисенсе ГСП у првом систему реакције ланчане синтезе од 20 μл.

2. Повећајте температуру очувања топлоте реверзне транскрипције:

Да би се у потпуности искористила ГСП специфичност, треба користити реверзну транскриптазу са високом термичком стабилношћу.Реверзна транскриптаза стабилна на топлоту може се изоловати на вишим температурама да би се повећала строгост реакције.На пример, ако се ГСП жари на 55°Ц, онда се специфичност ГСП-а не користи у потпуности ако се реверзна транскрипција врши на 37°Ц са ниском ригорозношћу коришћењем АМВ или М-МЛВ.Међутим, СуперСцрипⅡ и ​​ТхермоСцрипт могу да реагују на 50℃ или више, што елиминише неспецифичне производе произведене на нижим температурама.За максималну специфичност, мешавина РНК/прајмера може се директно пренети са температуре денатурације од 65℃ на температуру задржавања реверзне транскрипције уз додавање претходно загрејане 2 к реакционе смеше (термичко покретање синтезе цДНК).Ово помаже у спречавању упаривања база између молекула на ниским температурама.Коришћење ПЦР инструмента поједностављује многе температурне прелазе потребне за РТ-ПЦР.

3. Смањите контаминацију геномске ДНК:

Једна потенцијална потешкоћа са РТ-ПЦР-ом је да РНК контаминира геномску ДНК.Употреба бољих метода одвајања РНК, као што је Тризол реагенс, смањује контаминацију геномске ДНК у препаратима РНК.Да би се избегли производи произведени од геномске ДНК, РНК се може третирати са ДНАсⅠ степена амплификације да би се уклонила контаминирана ДНК пре реверзне транскрипције.Узорци су држани на 65 ℃ у 2,0 мМ ЕДТА током 10 минута да би се прекинула варење ДНасеⅠ.ЕДТА хелатира магнезијумове јоне да спречи хидролизу РНК зависну од јона магнезијума која се јавља на високим температурама.

Да би се одвојила амплификована цДНК од продукта амплификације геномске ДНК, могу се дизајнирати прајмери ​​који се посебно жаре са одвојеним егзоном.ПЦР производи изведени из цДНК биће краћи од оних добијених од контаминиране геномске ДНК.Контролисани експеримент без реверзне транскрипције се такође изводи на сваком РНК шаблону да би се утврдило да ли је дати фрагмент из геномске ДНК или цДНК.ПЦР производи добијени у одсуству реверзне транскрипције су изведени из генома.

Сродних производа

РТ-ПЦР Еаси^ᵀᴹја (један корак)

-Комплет у једном кораку омогућава да се реверзна транскрипција и ПЦР спроводе у истој епрувети.Потребно је само додати шаблон РНК, специфичне ПЦР прајмере и ддХ без РНазе₂O.

- Квантитативна анализа РНК у реалном времену може се извршити брзо и тачно.

-Кит користи јединствени Форегене реагенс реверзне транскрипције и Форегене ХотСтар Так ДНК полимеразу у комбинацији са јединственим реакционим системом за ефикасно побољшање ефикасности амплификације и специфичности реакције.

-Оптимизовани реакциони систем чини да реакција има већу осетљивост детекције, јачу термичку стабилност и бољу толеранцију.

РТ Еаси ИИ (са ГДНасе) главни премикс за прву синтезу ЦДНА за ПЦР у реалном времену са ГДНасе

-Ефикасна способност уклањања гДНК, која може уклонити гДНК у шаблону у року од 2 минута.

- Ефикасан систем реверзне транскрипције, потребно је само 15 минута да се заврши синтеза првог ланца цДНК.

-Сложени шаблони: шаблони са високим садржајем ГЦ и сложеном секундарном структуром се такође могу обрнути са великом ефикасношћу.

- Високоосетљиви систем реверзне транскрипције, шаблони на нивоу пг такође могу да добију висококвалитетну цДНК.

-Систем реверзне транскрипције има високу термичку стабилност, оптимална температура реакције је 42 ℃, а и даље има добре перформансе реверзне транскрипције на 50 ℃.