1. Основна знања (ако желите да видите експериментални део, пренесите директно у други део)
Као дериватна реакција конвенционалног ПЦР-а, ПЦР у реалном времену углавном прати промену количине производа амплификације у сваком циклусу реакције ПЦР амплификације у реалном времену кроз промену флуоресцентног сигнала и квантитативно анализира почетни шаблон кроз однос између цт вредности и стандардне криве.
Специфични подаци РТ-ПЦР суосновна линија, праг флуоресценцијеиЦт вредност.
| основна линија: | Вредност флуоресценције 3.-15. циклуса је основна (базна линија), која је узрокована повременом грешком мерења. |
| Праг (праг): | Односи се на границу детекције флуоресценције постављену на одговарајућу позицију у региону експоненцијалног раста криве амплификације, генерално 10 пута од стандардне девијације основне линије. |
| ЦТ вредност: | То је број ПЦР циклуса када вредност флуоресценције у свакој реакционој епрувети достигне праг. Вредност Цт је обрнуто пропорционална количини почетног шаблона. |
Уобичајене методе обележавања за РТ-ПЦР:
| методом | предност | недостатак | обим примене |
| СИБР ГреенⅠ | Широка примена, осетљива, јефтина и практична | Захтеви за прајмер су високи, склони су неспецифичним тракама | Погодан је за квантитативну анализу различитих циљних гена, истраживања експресије гена и истраживања трансгених рекомбинантних животиња и биљака. |
| ТакМан | Добра специфичност и висока поновљивост | Цена је висока и погодна само за одређене циљеве. | Детекција патогена, истраживање гена отпорности на лекове, процена ефикасности лекова, дијагноза генетских болести. |
| молекуларни светионик | Висока специфичност, флуоресценција, ниска позадина | Цена је висока, погодна је само за одређену намену, дизајн је тежак, а цена је висока. | Специфична генска анализа, СНП анализа |
2. Експериментални кораци
2.1 О експерименталном груписању- у групи мора бити више бунара и мора бити биолошких понављања.
| ① | Празна контрола | Користи се за откривање статуса раста ћелија у експериментима |
| ② | Негативна контрола сиРНА (неспецифична сиРНА секвенца) | Покажите специфичност деловања РНАи.сиРНА може изазвати неспецифичан одговор на стрес у концентрацији од 200 нМ. |
| ③ | Контрола трансфекционог реагенса | Искључити токсичност реагенса за трансфекцију на ћелије или ефекат на експресију циљног гена |
| ④ | сиРНА против циљног гена | Смањите експресију циљног гена |
| ⑤ (опционо) | позитивна сиРНА | Користи се за решавање проблема са експерименталним системом и оперативним проблемима |
| ⑥ (опционо) | Флуоресцентна контрола сиРНА | Ефикасност трансфекције ћелија може се посматрати под микроскопом |
2.2 Принципи пројектовања прајмера
| Повећана величина фрагмента | Пожељно на 100-150бп |
| Дужина прајмера | 18-25бп |
| ГЦ садржај | 30%-70%, пожељно 45%-55% |
| Тм вредност | 58-60℃ |
| Низ | Избегавајте Т/Ц континуирано;А/Г континуирано |
| 3 крај секвенце | Избегавајте ГЦ богате или АТ богате;терминална база је пожељно Г или Ц;најбоље је избегавати Т |
| Комплементарност | Избегавајте комплементарне секвенце од више од 3 базе унутар прајмера или између два прајмера |
| Специфичност | Користите претрагу бластирања да потврдите специфичност прајмера |
①СиРНА је специфична за врсту, а секвенце различитих врста ће бити различите.
②СиРНА је упакована у прах осушен замрзавањем, који се може стабилно чувати 2-4 недеље на собној температури.
2.3 Алати или реагенси које треба унапред припремити
| Пример (интерна референца) | Укључујући два напред и назад |
| Прајмери (циљни ген) | Укључујући два напред и назад |
| Циљна Си РНК (3 траке) | Генерално, компанија ће синтетизовати 3 траке, а затим изабрати једну од три помоћу РТ-ПЦР |
| Трансфецтион Кит | Липо2000 итд. |
| Комплет за брзу екстракцију РНК | За екстракцију РНК након трансфекције |
| Комплет за брзу обрнуту транскрипцију | за синтезу цДНК |
| ПЦР Амплифицатион Кит | 2×Супер СИБР зелена кПЦР Мастер Мик |
2.4 Што се тиче питања на која треба обратити пажњу у конкретним експерименталним корацима:
①сиРНА процес трансфекције
1. За наношење, можете одабрати плочу са 24 бунара, плочу са 12 базенчића или плочу са 6 бунарчића (просечна концентрација РНК предложена у сваком бунарчићу плоче са 24 јажица је око 100-300 нг/уЛ), а оптимална густина трансфекције ћелија је до 60%-80% или тако
2. Кораци трансфекције и специфични захтеви су стриктно у складу са упутствима.
3. Након трансфекције, узорци се могу прикупити у року од 24-72 сата за детекцију мРНА (РТ-ПЦР) или детекцију протеина у року од 48-96 сати (ВБ)
② Процес екстракције РНК
1. Спречити контаминацију егзогеним ензимима.То углавном укључује стриктно ношење маски и рукавица;коришћењем стерилисаних врхова пипета и ЕП епрувета;вода коришћена у експерименту мора бити без РНасе.
2. Препоручује се да се уради два пута као што је предложено у комплету за брзу екстракцију, што ће заиста побољшати чистоћу и принос.
3. Отпадна течност не сме да додирује РНК колону.
③ Квантификација РНК
Након што се РНК екстрахује, може се квантифицирати директно помоћу Нанодроп-а, а минимално очитавање може бити само 10 нг/ул.
④ Процес обрнуте транскрипције
1. Због високе осетљивости РТ-кПЦР, потребно је направити најмање 3 паралелна бунара за сваки узорак како би се спречило да наредни Цт буде превише различит или да СД буде превелик за статистичку анализу.
2. Немојте више пута замрзавати и одмрзавати Мастер мик.
3. Свака цев/рупа мора бити замењена новим врхом!Немојте стално користити исти врх пипете за додавање узорака!
4. Филм причвршћен за плочу са 96 бунарчића након додавања узорка треба да се изглади плочом.Најбоље је центрифугирати пре него што га ставите на машину, тако да течност на зиду цеви може да тече и уклони ваздушне мехуриће.
⑤ Анализа заједничке криве
| Нема периода логаритамског раста | Могућа велика концентрација шаблона |
| Нема ЦТ вредности | Нетачни кораци за детекцију флуоресцентних сигнала; деградација прајмера или сонди – њен интегритет се може открити ПАГЕ електрофорезом; недовољна количина шаблона; деградација шаблона – избегавање уношења нечистоћа и поновљено замрзавање и одмрзавање у припреми узорка; |
| Цт>38 | Ниска ефикасност појачања;ПЦР производ је предугачак;разне компоненте реакције се разграђују |
| Линеарна крива појачања | Сонде могу бити делимично деградиране поновљеним циклусима замрзавања-одмрзавања или продуженим излагањем светлости |
| Разлика у дуплираним рупама је посебно велика | Реакциони раствор није потпуно истопљен или реакциони раствор није помешан;термално купатило ПЦР инструмента је контаминирано флуоресцентним супстанцама |
2.5 О анализи података
Анализа података кПЦР-а може се поделити на релативну квантификацију и апсолутну квантификацију.На пример, ћелије у третираној групи у поређењу са ћелијама у контролној групи,
Колико пута се мења иРНК Кс гена, ово је релативна квантификација;у одређеном броју ћелија иРНК Кс гена
Колико копија има, ово је апсолутна квантификација.Обично оно што највише користимо у лабораторији је релативна квантитативна метода.обично,метода 2-ΔΔцтсе највише користи у експериментима, тако да ће само овај метод овде бити детаљно представљен.
2-ΔΔцт метода: Добијени резултат је разлика у експресији циљног гена у експерименталној групи у односу на циљни ген у контролној групи.Захтева се да ефикасност амплификације и циљног гена и интерног референтног гена буде близу 100%, а релативно одступање не би требало да прелази 5%.
Метод обрачуна је следећи:
Δцт контролна група = цт вредност циљног гена у контролној групи – цт вредност интерног референтног гена у контролној групи
Δцт експериментална група = цт вредност циљног гена у експерименталној групи – цт вредност интерног референтног гена у експерименталној групи
ΔΔцт=Δцт експериментална група-Δцт контролна група
На крају, израчунајте вишеструку разлику у нивоу израза:
Цханге Фолд=2-ΔΔцт (одговара функцији Екцел-а је ПОВЕР)
Сродни производи:
Време поста: 20. мај 2023
