Традиционалне реверзне транскриптазе не могу толерисати високе температуре (оптимална температура за активност ММЛВ је 37-50°Ц, а АМВ је 42-60°Ц).Сложенија вирусна РНК се не може ефикасно реверзно транскрибовати у цДНК на ниским температурама, што резултира ефикасношћу детекције.Традиционални РТ-кПЦР генерално захтева учешће два кључна ензима (реверзна транскриптаза и ДНК полимераза), што онемогућава поједностављење рада реакционог система и смањење трошкова.Овде ћемо представити две реверзне транскриптазе отпорне на високе температуре, ТтХ и РевТак.Ова два ензима имају и функцију ДНК полимеразе, па се називају бифункционалним ензимима.

ТтХ ДНК полимераза

Сигурно сте чули за ТтХ, који је изведен из термофилне бактерије Тхермус тхермопхилус ХБ8.У присуству двовалентних катјона као што је Мг2+, има активност ДНК полимеразе.Широко се користи у ПЦР реакцијама као што је Так ензим, али има већу отпорност на топлоту од Так ензима, тако да такође има бољи ефекат на ПЦР са шаблонима са високим садржајем ГЦ.

· Овај ензим у основи нема активност 3′→5′ егзонуклеазе и 5′→3′ егзонуклеазне активности, тако да се може користити и за дидеокси секвенцирање.

· Овај ензим има активност РТасе.У присуству Мн2+, активност РТазе ће бити појачана.Користећи ову функцију, може се користити за обављање реакције реверзне транскрипције и ПЦР реакције у истој епрувети, односно РТ-ПЦР у једном кораку.Међутим, у присуству Мн2+, тачност РТ-ПЦР није висока.РТ активност нема никакве везе са активношћу РНАазе Х.

· Повећана активност Ттх-ДНК полимеразе (пХ9, оптимално +55℃～+70℃, максимално +95℃) превазилази проблеме узроковане секундарном структуром РНК.Добијена цДНК се може амплифицирати ПЦР-ом са истим ензимом у присуству Мг2+ јона.

· Способност Ттх-ДНК полимеразе да изврши реверзну транскрипцију и амплификацију ДНК на високим температурама чини овај ензим корисним за квантитативну РТ-ПЦР, клонирање и анализу генске експресије ћелијске и вирусне РНК.
· Ттх-ДНК полимераза се користи за РТ-ПЦР за амплификацију РНК до 1 кб.

Карактеристике и предности

Ттх ДНК полимераза:

• Обезбедите оптимизовану величину производа ланчане реакције полимеразе (ПЦР), најмање 1000 бп у РТ-ПЦР реакцији

• Прихватите модификовани деоксирибонуклеозид трифосфат као супстрат

• Није повезано са активношћу РНазе Х

• Има високу термичку стабилност за превазилажење проблема, обично повезаних са високом секундарном структуром присутном у РНК

РевТак РТ-ПЦР ДНК полимераза

ДНК полимераза отпорна на топлоту са активношћу реверзне транскриптазе

РевТак-РТ-ПЦР-ДНК полимераза је конструисан, високо отпоран на топлоту, двоструко функционалан ензим са активностима реверзне транскриптазе и ДНК полимеразе добијене усмереном и вештачком еволуцијом.

· Полуживот РевТак РТ-ПЦР ДНК полимеразе на 95°Ц је дужи од 40 минута.

· РевТак РТ-ПЦР ДНК полимераза омогућава високотемпературну реверзну транскрипцију директно са РНК шаблона, а корак реверзне транскрипције може се поновити више пута да би се генерисало више цДНК шаблона.

· РевТак РТ-ПЦР ДНК полимераза омогућава РТ-ПЦР „нулти корак” (без изотермног корака реверзне транскрипције), јер се у цикличном ПЦР продужетку, реверзна транскрипција и амплификација ДНК дешавају истовремено.Ово такође промовише реакцију реверзне транскрипције на високим температурама, чиме се минимизирају проблеми који се јављају при топљењу јаке секундарне структуре у РНК на високим температурама.

· Због формуле врућег старта засноване на аптамеру, РевТак РТ-ПЦР ДНК полимераза ће дати боље резултате када је температура жарења и проширења виша од 57°Ц.

· Пошто је ензим отпоран на топлоту, препоручује се пројектовање прајмера и сонди са веома високим тачкама топљења (>60°Ц).

· Препоручује се оптимизација температуре корака жарења/продуживања кроз температурни градијент током процеса постављања реакције.

· Што је температура виша, то је већа специфичност ПЦР-а.Циклус реверзне транскрипције се обично изводи на вишој температури од ПЦР циклуса, јер хибридизација ДНК прајмер: РНК шаблон обично има вишу тачку топљења него дуплекс ДНК прајмер: цДНК шаблон.

· РевТак РТ-ПЦР ДНК полимераза је генетски модификована и оптимизована, а величина ампликона је између 60-300 бп.

РевТак РТ-ПЦР граница детекције ДНК полимеразе достиже 4 копије/

Оптимизовани реакциони систем (успостављање прајмера високе тачке топљења) је приказан на слици.РТ-ПЦР вођен РевТак РТ-ПЦР ДНК полимеразом показује бољу осетљивост од ТакПатх 1-степ РТ-кПЦР мастер мешавине и нижу детекцију градијента разблажења узорка.

Више предности:

Функција брзог покретања → Почетни корак термичке денатурације се може прескочити.

Хот старт аптамер формула → Одмах обезбедите 100% ензимску активност и спречите неспецифично појачање на ниским температурама (<57°Ц).

Функција цепања → Корак екстракције РНК је изостављен, јер РевТак РТ-ПЦР ДНК полимераза такође може да обради узорке сирове реакције.Може одмах да уништи ћелијске мембране еукариота, бактерија и вируса у врућем РТ-ПЦР циклусу.

ИВД ниво сировине → високи стандарди квалитета и изузетно конкурентне цене