РНаза је осетљива реч коју многи студенти који често спроводе експерименте екстракције РНК не желе да чују.Потпуно наоружана, РНК која је коначно екстрахована са високо токсичним реагенсима фенолом и хлороформом је деградирана.Нисам се помирио!!!Данас, хајде да погледамо порекло чувене Рнасе.

Рибонуклеаза (РНасе), или РНаза, је нуклеаза која може хидролизовати РНК у мале молекуле.РНаза, као мали молекулски протеин, је необично стабилна .Конвенционална стерилизација паром на високим температурама и високим притиском и инхибитори протеина не могу је потпуно инактивирати.Стабилност РНазе углавном потиче од дисулфидних веза у структури.На пример, уобичајено коришћена РНКаза говеђег панкреаса има само 124 аминокиселине, али садржи 4 дисулфидне везе.Сумпорна веза и дисулфидна веза дају РНазу одличну термичку стабилност.Поред тога, рназа има релативно малу молекулску тежину и може брзо да поврати своју првобитну конформацију у многим случајевима.

Поред тога што је изузетно стабилан,РНазе су свеприсутне у лабораторији .РНаза је биолошки одбрамбени механизам.За ћелију је егзогена РНК често фатална.У поређењу са егзогеном ДНК, егзогена РНК је често опаснија.РНК се срећно транскрибује и преводи, тако да су скоро сви организми развили РНазе за одбрану од инвазије егзогене РНК.Према томе, бактеријске ћелије култивисане у лабораторији и ви који екстрахујете РНК одишу аромом РНКазе.Људске телесне течности (пљувачка, сузе, итд.) садрже велику количину РНКазе, тако да немојте плакати када се РНК разгради.Што више плачете, то је гора деградација РНК!!Сестра Даииу није погодна за екстракцију РНК!

Поред тога, ваша нежна кожа такође садржи много РНазе, а маркери, пипете, врата фрижидера и кваке на вратима које је кожа додирнула такође садрже РНазу.

Уз толико лутања, хајде да погледамо како да се носимо са РНасес.

Прва ствар на коју сви помисле када уклањају РНК јеДЕПЦ(диетил пирокарбонат).ДЕПЦ углавном денатурише протеин комбиновањем са имидазолним прстеном хистидина активне групе РНазе, чиме инхибира активност ензима.0,1% ДЕПЦ може имати бољи ефекат уклањања на Рназу, али морамо обратити пажњу да је ДЕПЦ познати канцероген, па треба обратити посебну пажњу приликом његове употребе.

За РНасе, морамо почети од два аспекта,први је да инхибира активност ендогене РНКазе

Конвенционални реагенси за екстракцију РНК као што су гванидин изотиоцијанат и ДТТ садржани у Тризолу могу отворити дисулфидну везу РНКазе, али још увек постоје неке РНазе, посебно у узорцима ткива, па обратите пажњу на ниску температуру.

1.Одмах потопите узорак ткива у течни азот након што га извадите или у комерцијални раствор за конзервацију РНК.

2.Након екстракције РНК узорка ћелије, додајте је у раствор за лизу и лизирајте је на кутији за лед

3. За млевење је најбоље користити течни азот када се узорци ткива хомогенизују.Када користите електрични хомогенизатор без течног азота, обратите пажњу на потпуно претходно хлађење адаптера за хомогенат.

Друга је егзогена ДНаза

1.Будите потпуно наоружани, носите лабораторијски мантил, носите маску и обавезно носите пар нових рукавица (не будите тако штедљиви!! Треба напоменути да је Тризол супер корозиван, а такође је веома јак кроз рукавице, тако да вам не капа по рукама).

2.Сви коришћени врхови пипета, ЕП епрувете, ПЦР епрувете и друга опрема морају бити третирани де-РНасе.Може се натопити у 0,1% ДЕПЦ, а затим под високим притиском.Обратите пажњу на рад у хауби.Локални тирани могу директно да купе потрошни материјал за уклањање ензима.

ПС: Дозволите ми да вам кажем лењи метод.Иако висока температура и висок притисак не могу у потпуности да уклоне РНазу, они ће уклонити велики део ње.2 пута високе температуре и високог притиска имају добар ефекат, а екстракција РНК има мали ефекат.

3.Алкохол може денатурисати протеине,тако да се сто за екстракцију РНК може обрисати 75% алкохола , а рукавице се могу и попрскати алкохолом.

4.Коначни раствор за растварање РНК и епрувету за центрифугу такође треба да се третирају де-РНасе.ДЕПЦ вода је уобичајени раствор за растварање РНК.Хајде да разговарамо о правилном начину припреме ДЕПЦ воде (не заборавите да препакујете комерцијални ДЕПЦ када га купите)

Додати ДЕПЦ у ултра чисту воду на 1:1000, добро промућкати, оставити да стоји преко ноћи на 37°Ц и стерилисати на 121°Ц под високом температуром и високим притиском 15 минута.ДЕПЦ вода се може чувати на -20°Ц у аликвотима од 1мл.

Коначно, да сумирамо: ниска температура је кључ, потрошни материјал се добро рукује, потпуно наоружани и мање приче!

Е, то је то за данашњу стратегију.Желим вам сву РНК концентрацију и чистоћу коју сте споменули.Оба А260/А280 су 2.0!!!

Наравно, ако користите арад на собној температури комплет за екстракцију РНК, можда нећете наићи на горе наведене проблеме.

Рад на собној температури, без додавања ДНазе, екстрахује укупну РНК из ћелија за 11 минута, и екстрахује укупну РНК из животињских ткива или биљака за 30 минута.

За пробне узорке контактирајте:overseas@foregene.com

Сродни производи:

хттпс://ввв.фореивд.цом/целл-тотал-рна-исолатион-кит-продуцт/

хттпс://ввв.фореивд.цом/анимал-тотал-рна-исолатион-кит-продуцт/

хттпс://ввв.фореивд.цом/плант-тотал-рна/