У кПЦР експериментима, дизајн прајмера је такође веома важна карика.Да ли су прајмери ​​прикладни или не уско је повезано са тим да ли ефикасност амплификације достиже стандард, да ли су појачани производи специфични и да ли су експериментални резултати доступни.
Дакле, како побољшати специфичност кПЦР прајмера?Висока ефикасност појачања?
Данас ћемо вас одвести да заједно дизајнирате кПЦР прајмере и дозволите да дизајн кПЦР прајмера постане ефикасна вештина учења у експериментима.
Приликом дизајнирања кПЦР прајмера, обично обратите пажњу на следеће тачке: прајмери ​​треба да буду дизајнирани преко интрона што је више могуће, дужина производа треба да буде 100-300 бп, вредност Тм треба да буде што је могуће ближе 60°Ц, а узводни и низводни прајмери ​​треба да буду што је могуће ближе, а крај прајмера треба да буде Г или Ц, итд.
1. Дизајн прајмера који обухватају интроне
Приликом дизајнирања кПЦР прајмера, одабир прајмера дизајнираних преко интрона може спречити амплификацију гДНК шаблона, а сви производи су изведени из амплификације цДНК, чиме се елиминише утицај контаминације гДНК.
2. Дужина прајмера
Дужина прајмера је генерално између 18-30 нт, а дужина производа амплификације треба да се контролише између 100-300 бп колико год је то могуће.
Ако је прајмер прекратак, то ће довести до неспецифичног појачања, а ако је предугачак, лако ће формирати секундарну структуру (као што је структура укоснице).Ако је производ амплификације предугачак, није погодан за реакцију полимеразе, што ће утицати на ефикасност ПЦР амплификације.
3. ГЦ садржај и Тм вредност
Садржај ГЦ прајмера треба контролисати између 40% и 60%.Ако је превисок или пренизак, није погодан за покретање реакције.Садржај ГЦ прајмера унапред и обрнуто треба да буде приближно исти да би се добила иста вредност Тм и температура жарења.
Вредност Тм треба да буде између 55-65°Ц колико год је то могуће, углавном око 60°Ц, а вредност Тм узводно и низводно треба да буде што је могуће ближе, пожељно не више од 4°Ц.
4. Избегавајте да изаберете А на 3′ крају прајмера
Када се 3′ крај прајмера не поклапа, постоје велике разлике у ефикасности синтезе различитих база.Када је последња база А, она такође може да покрене синтезу ланца чак и у случају неусклађености, а када је последња база Т Када, ефикасност индукције неусклађености је знатно смањена.Зато покушајте да избегнете избор А на 3′ крају прајмера, а боље је изабрати Т.
Ако је у питању прајмер сонде, 5′ крај сонде не може бити Г, јер чак и када је једна Г база повезана са ФАМ флуоресцентном репортерском групом, Г такође може угасити флуоресцентни сигнал који емитује ФАМ група, што резултира лажно негативним резултатима.Појавити.
5. Основна дистрибуција
Расподела четири базе у прајмеру је пожељно насумична, избегавајући више од 3 узастопна Г или Ц на крају 3′ и више од 3 узастопнаГ или Ц је лако генерисати упаривање у региону секвенце богате ГЦ.
6. Регион дизајна прајмера треба да избегава сложене секундарне структуре.
Секундарна структура формирана од једног ланца производа амплификације ће утицати на несметан напредак ПЦР-а.Предвиђањем да ли постоји секундарна структура у циљној секвенци унапред, покушајте да избегнете овај регион у дизајну прајмера.
7. Сами прајмери ​​и између прајмера треба да покушају да избегну узастопне комплементарне базе.
Не може постојати узастопна комплементарност од 4 базе између самог прајмера и прајмера.Сам прајмер не би требало да има комплементарну секвенцу, иначе ће се сам савијати и формирати структуру укоснице, што ће утицати на комбинацију прајмера и шаблона за жарење.
Комплементарне секвенце не могу постојати између узводних и низводних прајмера.Комплементарност између прајмера ће произвести димере прајмера, што ће смањити ефикасност ПЦР-а и чак утицати на квантитативну тачност.Ако су структуре прајмера-димера и укосница неизбежне, вредност △Г не би требало да буде превисока (треба да буде мања од 4,5 кцал/мол).
8. Прајмери ​​појачавају циљни специфичан производ.
Крајњи циљ кПЦР детекције је разумевање обиља циљног гена.Ако дође до неспецифичног појачања, квантификација ће бити нетачна.Стога, након што су прајмери ​​дизајнирани, потребно их је тестирати од стране БЛАСТ-а, а специфичност производа се упореди у бази података секвенци.
Затим, узимамо људски ГАС6 (специфичан за заустављање раста 6) ген као пример за дизајнирање кПЦР прајмера.
01 упит ген
Хомо ГАС6преко НЦБИ .Овде треба да обратимо пажњу на упоређивање имена гена и врсте како бисмо били сигурни да су конзистентни.
02 Пронађите секвенцу гена
(1) Ако је циљна секвенца геномска ДНК, изаберите прву, а то је секвенца геномске ДНК гена.
(2) Ако је циљна секвенца мРНА, изаберите другу.Након уноса, кликните на „ЦДС“ у табели испод.Смеђа позадинска секвенца је кодирајућа секвенца гена.
03 Прајмери ​​за дизајн
Уђите у Пример-БЛАСТ интерфејс
Унесите редни број гена или секвенцу у Фаста формату у горњем левом углу и попуните релевантне параметре.

Кликните на „Набави прајмере“ и НЦБИ ће се појавити да вам каже да ће такав избор параметара бити појачан на друге варијанте спајања.Можемо проверити различите варијанте спајања и послати их да бисмо добили одговарајући пар прајмера (као што је приказано на слици испод).Овај процес може потрајати десетинама секунди.
Температуре жарења ових парова прајмера су око 60°Ц.У складу са сврхом експеримента, за експеримент изаберите прајмере умерене дужине, добре специфичности и мање самодопуњавања прајмера, а успех је прилично висок!
04Провера специфичности прајмера
У ствари, поред дизајна прајмера, Пример-Бласт такође може да процени прајмере које смо сами дизајнирали.Вратите се на страницу за дизајн прајмера, унесите горњи и низводни прајмер који смо дизајнирали, а други параметри неће бити прилагођени.Након слања, можете видети да ли пар прајмера постоји и на другим генима.Ако су сви приказани на гену који желимо да појачамо, што указује да је специфичност овог пара прајмера одлична!(На пример, ово је једини резултат основног упита!)

05 Процена квалитета прајмера
Која врста прајмера је „савршени” прајмер који комбинује „ефикасност појачања до стандарда”, „појачане карактеристике производа” и „поуздане експерименталне резултате”?
Ефикасност појачања

крива топљења
Ефикасност амплификације прајмера достиже 90%-110%, што значи да је ефикасност амплификације добра, а крива топљења има један пик и обично Тм>80°Ц, што значи да је специфичност амплификације добра.
 
Сродни производи:
ПЦР у реалном времену Еаси–СИБР ГРЕЕН И
ПЦР у реалном времену Еаси-Такман