ПЦР у реалном времену, такође познат као квантитативни ПЦР или кПЦР, је метода за праћење и анализу производа ПЦР амплификације у реалном времену.
Пошто квантитативни ПЦР има предности једноставног рада, брзог и практичног, високе осетљивости, добре поновљивости и ниске стопе контаминације, он се широко користи у медицинском тестирању, процени ефикасности лекова, истраживању експресије гена, трансгеном истраживању, детекцији гена, детекцији патогена, откривању животиња и биљака., тестирање хране и друга поља.
Дакле, било да се бавите основним истраживањима из природних наука, или сте запослени у фармацеутским компанијама, сточарским компанијама, прехрамбеним компанијама, па чак и запосленима у бироима за улазно-излазну инспекцију и карантин, одељењима за праћење животне средине, болницама и другим јединицама, бићете мање или више изложени Или морате да знате знање о савладавању квантитативне ПЦР.

Принцип ПЦР у реалном времену

ПЦР у реалном времену је метода у којој се у ПЦР реакциони систем додају флуоресцентне супстанце, а интензитет сигнала флуоресценције у процесу ПЦР реакције се прати у реалном времену квантитативним ПЦР инструментом и на крају се анализирају и обрађују експериментални подаци.

【Крива појачања】је крива која описује динамички процес ПЦР.Крива амплификације ПЦР-а заправо није стандардна експоненцијална крива, већ сигмоидна крива.

[Платформска фаза криве појачања]Са повећањем броја ПЦР циклуса, инактивацијом ДНК полимеразе, исцрпљивањем дНТП-а и прајмера и инхибицијом реакције синтезе нуспроизводом реакције пирофосфатом, итд., ПЦР се не шири увек експоненцијално., и на крају ће ући у плато.

[Регион експоненцијалног раста криве појачања]Иако плато фаза веома варира, у одређеном региону експоненцијалног региона раста криве амплификације, поновљивост је веома добра, што је веома важно за квантитативну анализу ПЦР.

[Вредност прага и вредност Цт]Поставили смо граничну вредност детекције флуоресценције на одговарајућу позицију у области експоненцијалног раста криве амплификације, односно граничну вредност (Тхресхолд).Пресек вредности прага и криве појачања је вредност Цт, односно вредност Цт се односи на број циклуса (Тхресхолд Цицле) када се достигне вредност прага.

Графикон испод јасно показује однос између линије прага и криве појачања, прага и вредности Цт.

【Како квантифицирати?】

Математичком теоријом је доказано да вредност Цт има инверзну линеарну везу са логаритмом броја почетних шаблона.ПЦР у реалном времену прати производе ПЦР амплификације у реалном времену и квантификује их током фазе експоненцијалне амплификације.

За сваки циклус ПЦР-а, ДНК се експоненцијално повећала за 2 пута и убрзо достигла плато.

Под претпоставком да је количина почетне ДНК А₀ , након н циклуса, теоретска количина ДНК производа може се изразити као:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Затим, што је већа почетна количина ДНК А 0, то пре количина амплификованог производа достигне вредност детекције Ан, а број циклуса при достизању Ан је вредност Цт.Односно, што је већа почетна количина ДНК А 0, то је крива амплификације раније достигла врхунац, а сходно томе је и потребан број циклуса н мањи.

Спроводимо градијентно разблаживање стандарда познате концентрације и користимо га као шаблон за ПЦР у реалном времену, а серија кривуља амплификације ће се добити у једнаким интервалима по редоследу почетне количине ДНК од више до мање.Према линеарном односу између вредности Цт и логаритма броја почетних шаблона, а[стандардна крива] може се креирати.

Заменом Цт вредности узорка са непознатом концентрацијом у стандардну криву, може се добити почетна шаблонска количина узорка непознате концентрације, што је квантитативни принцип ПЦР у реалном времену.

Метода детекције ПЦР у реалном времену

ПЦР у реалном времену детектује производе ПЦР амплификације детекцијом интензитета флуоресценције у реакционом систему.

Принцип методе уградње флуоресцентне боје】

Флуоресцентне боје, као што је ТБ Греен ® , може се неспецифично везати за дволанчану ДНК у ПЦР системима и флуоресцирати након везивања.

Интензитет флуоресценције у реакционом систему се експоненцијално повећавао са повећањем ПЦР циклуса.Детектовањем интензитета флуоресценције, количина ДНК амплификације у реакционом систему може се пратити у реалном времену, а затим се количина почетног шаблона у узорку може обрнуто проценити.

【Принцип методе флуоресцентне сонде】

флуоресцентна сондаје секвенца нуклеинске киселине са флуоресцентном групом на 5′ крају и групом за гашење на 3′ крају, која се може специфично везати за шаблон.Када је сонда нетакнута, флуоресценцију коју емитује флуорофор гаси група за гашење и не може флуоресцирати.Када се сонда разгради, флуоресцентна супстанца ће се дисоцирати и емитовати флуоресценцију.

У ПЦР реакциони раствор се додаје флуоресцентна сонда.Током процеса жарења, флуоресцентна сонда ће се везати за специфичну позицију шаблона.Током процеса екстензије, 5′→3′ егзонуклеазна активност ПЦР ензима може да разгради флуоресцентну сонду хибридизовану са шаблоном, а флуоресцентна супстанца се дисоцира да емитује флуоресценцију.Одређивањем интензитета флуоресценције сонде у реакционом систему, може се постићи сврха праћења количине амплификације ПЦР производа.

【Избор методе детекције флуоресценције】

Ако се користи за разликовање секвенци са високом хомологијом и обављање мултиплекс ПЦР детекције као што је анализа СНП типизације, метода флуоресцентне сонде је незаменљива.
За друге ПЦР експерименте у реалном времену, може се користити једноставна, лака и јефтина метода флуоресцентне химере.

сонде Јака специфичност, способна за мултиплекс ПЦР

Недостатак

Захтеви високе специфичности за амплификацију;

мултиплекс ПЦР се не може извршити.Потреба за дизајнирањем специфичних сонди, висока цена;

понекад је дизајн сонде тежак

Сродни производи: