РТ-кПЦР је основни експеримент молекуларне биологије и сви морају бити упознати са њим.Углавном укључује три корака: екстракцију РНК, реверзну транскрипцију у цДНК и флуоресцентни квантитативни ПЦР у реалном времену.Не помаже, шта се дешава?Вероватно је да постоји проблем саексперимент реверзне транскрипције!Иако се чини да експерименту реверзне транскрипције треба додати само РНК, дНТП, прајмере иреверзне транскриптазеу епрувету за центрифугу и добро промешати, али у стварном процесу рада још увек има много детаља на које треба обратити пажњу.Хајде да научимо о томе!

Како проценити квалитет РНК?
За добијање цДНК, квалитет РНК је критичан!Квалитет РНК се може открити углавном из два аспекта:
(1) Интегритет РНК:Интегритет РНК се може проверити електрофорезом у агарозном гелу. Узимајући еукариоте као пример, комплетна укупна РНК има три јасне траке, молекулске тежине од великих до малих су 28С, 18С и 5С, а 28С је двоструко светлија од 18С;ако се виде три траке, али је тип траке замагљен или Дифузија значи да је РНК делимично деградирана.У овом тренутку, одмах извршите реакцију обрнуте транскрипције и повећајте унос шаблона на одговарајући начин;ако се може видети само трака са малом молекулском тежином или без траке, РНК је потпуно деградирана и треба је поново екстраховати.Агилент 2100 указује на интегритет РНК са дијаграмом пика и РИН вредношћу.Ако је нуклеинска киселина нетакнута, основна линија електроферограма је равна;ако је нуклеинска киселина озбиљно деградирана, основна линија је неуједначена и појављује се више пикова деградације;вредност РИН одражава интегритет РНК, у опсегу од 0-10, што је већа вредност, то је бољи квалитет РНК.Па, што је већи степен комплетности.
(2) Чистоћа РНК:Однос ОД260/280 може се детектовати УВ спектрофотометријом.Ако је однос ОД260/280 између 1,9 и 2,1, чистоћа је веома добра.
Преостала геномска ДНК може довести до нетачних квантитативних резултата
Када се РНК екстрахује, РНК коју добијемо може бити помешана са геномском ДНК (гДНК) која није очишћена.Стога ће цДНК након реверзне транскрипције такође бити помешана сагДНК.Током низводногкПЦРреакција,цДНКи гДНК могу бити амплифицирани истовремено, што резултира релативно малом ЦТ вредношћу, тако да резултати могу бити пристрасни.
Дакле, шта да радимо у овој ситуацији?Форегенепредлаже:
(1) Извршити чишћење генома на обрнутој РНК, која се може уклонити екстракцијом колоне током екстракције РНК;
(2) Третирајте екстраховану РНК са ДНазомI , али га завршите са ЕДТА;
реагенса реверзне транскрипцијеса модулима за чишћење генома;

Како одабрати прајмере за реверзну транскрипцију?
Прајмери ​​реверзне транскрипције такође утичу на исход реакције реверзне транскрипције.Можете одабрати насумичне прајмере, Олиго дТ или ген-специфичне прајмере за реверзну транскрипцију у складу са специфичним околностима експеримента:
(1) Конкретни транскрипти: препоручују се генски специфични прајмери;
(2) Дуги фрагмент транскрипта: Препоручују се олиго дТ/генски специфични прајмери;
(3) Унутрашњи фрагменти транскрипата дугог сегмента: генски специфични прајмери/ насумични прајмери ​​/ насумични прајмери ​​+ Олиго дТ.Ако се изврши следећи кПЦР експеримент, Олиго дТ се не може користити сам, јер коришћење самог Олиго дТ-а може да изазове пристрасност 3′ краја, што доводи до нетачних резултата кПЦР експеримента;
(4) миРНА: Могу се користити прајмери ​​у облику петље или репови.

Колико пута цДНК производа реверзне транскрипције треба разблажити за квантификацију?
Након добијања цДНК производа реверзне транскрипције, веома је важно колико пута цДНК треба разблажити за кПЦР експерименте.Ако је концентрација цДНК превисока или прениска, то може утицати на ефикасност амплификације.Може ли се измерити концентрација цДНК и како то урадити?
(1) Концентрација цДНК производа реверзне транскрипције не може се измерити, јер поред производа обрнуте транскрипције, производ реверзне транскрипције такође садржи пуфер заосталог реверзне транскрипције, реверзну транскриптазу, прајмере, итд., што ће ометати резултате мерења концентрације и узроковати ОД260/280, ОД260/ ОД260/ДНА однос не одражава абнормалан однос.У ово време, неки пријатељи ће рећи, онда ћу измерити концентрацију након пречишћавања;Овде Фореген жели да подсети да се цДНК не препоручује за пречишћавање, јер је дужина цДНК добијене преокретом другачија, а кратка цДНК ће бити изгубљена током пречишћавања.
(2) Па шта да се ради?Пре кПЦР експеримента, градијент разблажења цДНК се може одредити кроз пре-експеримент.На пример: користите основни раствор цДНК, 10-струко разблаживање и 100-струко разблаживање као шаблоне за кПЦР експерименте и изаберите фактор разблажења са ЦТ вредношћу у опсегу од 18-28.

Како миРНА треба да се реверзно транскрибују?
миРНА је једноланчана РНК малих молекула величине око 22 нт која не кодира протеин.Због своје кратке дужине, конвенционалну кПЦР методу је тешко директно квантифицирати, па је често потребно проширити миРНА;најчешће коришћене методе реверзне транскрипције за миРНА укључују методу матичне петље и методу репа.
Метода матичне петље је проширење миРНА додавањем прајмера петље стабла.Овај метод детекције има већу осетљивост и специфичност, али је проток детекције низак.Једна реверзна транскрипција може открити само једну миРНА и интерну референцу;метода додавања репа састоји се од два. Завршава се заједничким деловањем два ензима, а то су ПолиА полимераза и реверзна транскриптаза.ПолиА полимераза је одговорна за додавање ПолиА репова миРНА да би се повећала њена дужина, а реверзна транскриптаза врши реакцију реверзне транскрипције.Овај метод има високу пропусност детекције и може открити више миРНА и интерних референци у једној реверзној транскрипцији, али су осетљивост и специфичност ниске у методи матичне петље.