Сви говоре о принципу кРТ-ПЦР експеримента, дизајну прајмера, интерпретацији резултата, итд., али мислим да би требало да поделим са вама експериментални рад кРТ-ПЦР.Мало је, али се ради о резултатима.

Пре него што урадимо кРТ-ПЦР, морамо да имамо јасно разумевање сопствене РНК и метода рада.На крају крајева, наши напори су усмерени на постизање резултата, а не само на вежбање.Дакле, пре него што урадимо кРТ-ПЦР, морамо да утврдимо следеће проблеме (од којих су неки применљиви само на СИБР).

1 Да ли сте сигурни да ваша РНК није деградирана?

НаноДроп 2000 може детектовати само концентрацију и чистоћу РНК, али не може детектовати интегритет РНК.

Вредност РНК (број интензитета РНК) може да одражава интегритет РНК, који детектује систем Агилент 2100 Биоанализер.

Сл. Шематски дијаграм вредности РИН за различите узорке РНК (еукариоте)

Међутим, лабораторије углавном немају Агилент 2100 биоанализер.У овом случају можемо детектовати кроз формалдехидни гел, али је захтев за укупном количином РНК висок, па је најбржи метод коришћењем обичне гел електрофорезе.Неопходно је да буде у окружењу без нуклеаза, тако да је потребно испрати резервоар за електрофорезу, боцу за сол, носач за гел и чешаљ са ДЕПЦ водом.Агароза је такође без нуклеаза (све док је свеже отворена), а пуфер за пуњење треба да буде свеже отворен што је више могуће, са 1,2% гела.

Имајте на уму да гел мора бити потпуно растворен, иначе ће изазвати нехомогене траке, као што је приказано у узорку 9 на слици.Ако је напон превисок или ради предуго, створиће топлоту и изазвати деградацију РНК, тако да напон и време треба разумно контролисати.Поред тога, коришћење гела такође може додатно да утврди да ли у узорку има остатака ДНК и да уочи да ли постоји велики број задржаних трака у резервоару за дозирање.

Фигура.Детекција РНК гел електрофорезом

2 Да ли сте сигурни у концентрацију ваше цДНК?

Искуство велике браће у лабораторији је да се цДНК система од 20 ул добијена сваком инверзијом директно разблажи 20Кс, док се постдокторске сестре разблаже 10Кс.Обично зависим од ситуације.Пошто је квалитет РНК који помиње свака особа различит, ниво преокрета је такође различит, а технологија преокрета можда није стабилна.

Дакле, сваки пут када добијем обрнуту цДНК, прво ћу је разблажити око 3 пута, а затим ћу користити ген за одржавање да урадим РТ-ПЦР, број циклуса је генерално 25 циклуса, да бих идентификовао специфичну концентрацију, а затим одредио коначни фактор разблажења.

3 Да ли сте сигурни да су ваши прајмери ​​лаки за употребу?

Може да прође криву топљења кРТ-ПЦР, али ово и даље кошта.За лабораторије без много новца, када добију много прајмера, могу да користе обичан РТ-ПЦР да виде да ли је то једна трака и идентификују специфичност прајмера.Ако лабораторији не недостаје новца, специфичност свих прајмера може се идентификовати једном кроз криву топљења.

4 Да ли сте сигурни да су ваши експериментални услови одговарајући?

СИБР треба да буде заштићен од јаког светла, па покушајте да искључите горње светло када додајете СИБР реагенс, и само треба да користите пригушено светло да бисте га довршили.

Чувати СИБР на 4°Ц.Када се користи, нежно окрените горе-доле да бисте се добро промешали да бисте избегли стварање пене и немојте снажно мешати.

Неке млађе сестре воле да цртају ознаке на ПЦР плочи из страха да не помешају узорке, што је погрешно.Пошто је велика вероватноћа да ће ваши маркери утицати на прикупљање флуоресцентних сигнала, генерално препоручујем јуниорима да користе експерименталне свеске за помоћ у памћењу, као што је приказано у наставку.

Фигура.кРТ-ПЦР дијаграм пуњења узорка

5 Јесте ли сигурни да то радите како треба?

Обавезно носите рукавице, носите рукавице, носите рукавице и три пута реците важне ствари.

Да бих смањио излагање СИБР-а светлости, ја лично волим да прво додам шаблон, као што је приказано на слици испод.Према искуству, додавање мале количине шаблона ће вероватно изазвати грешке у узорковању.Због тога, да би минимизирао грешку узроковану додавањем мале количине шаблона, обично поново удвостручим узорак и удвостручим количину када додајем узорак да бих смањио количину додане Х2О2.

Фигура.Шематски дијаграм пуњења кРТ-ПЦР

Затим конфигуришите кРТ-ПЦР систем на следећи начин.

Фигура.Дијаграм припреме кРТ-ПЦР система

НАПОМЕНА: Процес конфигурације треба да се обави на леду.

Након додавања узорка, залепите провидни заптивни филм.Покушајте да не додирнете површину прозирне заптивне фолије рукама, само делујте из простора са обе стране филма.Зато што отисци прстију такође могу утицати на прикупљање флуоресцентних сигнала.Затим користите центрифугу за брзо центрифугирање 10 с при малој брзини како бисте спречили да узорак виси на зиду.

Сродни производи:

Целл Дирецт РТ-кПЦР комплет

РТ Еаси ИИ