РТ-кПЦР експеримент укључује екстракцију РНК и процену квалитета, реверзну транскрипцију и кПЦР три корака, сваки корак има много мера предострожности, детаљно ћемо их представити у наставку.

Ⅰ.Процена квалитета РНК

У РТ-кПЦР експерименту, након завршетка екстракције РНК, потребно је проценити квалитет РНК, а накнадни експеримент се може извести тек након што је квалификован.Методе евалуације обухватају спектрофотометар, Агилент гел електрофорезу, Агилент 2100 анализу, међу којима се најчешће користе спектрофотометар и метода детекције електрофорезом агарозног гела.Треба напоменути да ове две методе треба да се користе заједно да би се завршила детекција и анализа концентрације РНК, чистоће и интегритета, како би се обезбедио квалитет РНК.

Повезани комплет за изолацију РНК: 

Комплет за изолацију укупне РНК ћелија

Високо пречишћена и висококвалитетна укупна РНК може се добити из различитих култивисаних ћелија за 11 минута.

Комплет за изолацију укупне РНК животиња

Брзо и ефикасно издвајање укупне РНК високе чистоће и високог квалитета из различитих животињских ткива.

Спектрофотометар:

Спектрофотометар се углавном користи за одређивање концентрације и чистоће РНК, али не може да открије интегритет РНК и геномског остатка.Међу њима, А260/280 и А260/230 су важни параметри за детекцију чистоће РНК, а чистоћа РНК се може детектовати према флуктуацији њихових вредности:

1. 1.9< А260/280< 2.1, што указује да је чистоћа РНК добра;А260/280<1,9, што указује да може постојати остатак протеина у РНК;А260/280>2.1, што указује на могућу делимичну деградацију РНК, што се даље може потврдити електрофорезом у агарозном гелу.

2. 2.0< А260/230< 2.2, што указује да је чистоћа РНК добра;А260/230< 2.0, што указује да у РНК могу бити остаци органских реагенса, као што су феноли, етанол или шећери.

Електрофореза у агарозном гелу:

Тест електрофорезе у агарозном гелу може анализирати интегритет РНК, геном и протеинске остатке, али не може прецизно квантификовати концентрацију РНК или детектовати остатке органских реагенса.Узмите еукариотске РНК шаблоне на пример:

1. РНК је подвргнута електрофорези у агарозном гелу.Ако су на мапи гела биле само три појединачне траке 28сРНА, 18сРНА и 5.8сРНА, то указује да је екстрахована РНК нетакнута.Ако постоји феномен повлачења, то указује на делимичну деградацију РНК.

2. Ако постоји једна светла трака између рупе за лепак и траке 28сРНА, можда постоји остатак геномске ДНК.

3. Ако се у отвору за лепак појављују траке, то указује да можда постоје остаци протеина и других макромолекуларних супстанци.

Ⅱ. Реверзна транскрипција

Након што је екстракција РНК завршена, она мора да се преокрене у цДНК за наредне експерименте, тако да је корак преокрета неопходан.Реверзна транскрипција ће бити уведена избором реверзне транскриптазе и прајмера:

Избор реверзне транскриптазе:

Типичне реверзне транскриптазе укључују АМВ РТасе и ММЛВ РТасе.РНасе Х АМВ РТасе има јаку активност, кратку дужину синтезе, ниску количину синтезе и добру термичку стабилност (42 ~ 55 ℃).Активност РНасе Х ММЛВ РТасе је слаба, дужина синтезе је дуга, количина синтезе је висока, а термичка стабилност је лоша (37 ~ 42 ℃).

Пошто ензим РНасе Х има функцију деградације РНК шаблона, ММЛВ са слабом активношћу РНазе Х треба преференцијално да буде одабран током реверзне транскрипције, а након каснијег генетског инжењеринга, термичка стабилност ММЛВ је достигла квалитативни скок.Узимање ФорегенаПредвиђена реверзна транскриптаза (М-МЛВ за обрнуту транскрипцију) као пример, то је нова реверзна транскриптаза изражена у бактеријама које су конструисане Е. цоли коришћењем технологије генетске рекомбинације.То је рекомбинантна ДНК полимераза која синтетише комплементарни ланац ДНК из једноланчане РНК, ДНК или хибрида РНК:ДНК.Нема активност РНазе Х, јаку стабилност, јак РНК афинитет и високу осетљивост на детекцију.

 

Предвиђена реверзна транскриптаза (М-МЛВ за обрнуту транскрипцију)

Избор прајмера:

Генерално, РТ прајмери ​​спадају у три категорије: олиго дТ, насумични прајмери ​​и генски специфични прајмери.Изаберите одговарајуће прајмере за употребу у складу са различитим експерименталним захтевима.

1. Ако је шаблон еукариотског порекла и касна цДНК се користи за рутинску ПЦР амплификацију, препоручује се Олиго (дТ);Ако се следећи експеримент користи само за кПЦР, препоручује се мешање Олиго-а (дТ) са насумичним прајмерима да би се побољшала ефикасност реверзне транскрипције.

2. Ако је шаблон од прокариота, за реверзну транскрипцију треба изабрати насумичне прајмере или ген специфичне прајмере.

Ⅲ.кПЦР

Квантификација флуоресценције се углавном разрађује избором квантитативних метода, принципима дизајна прајмера, одабиром РОКС-а, конфигурацијом реакционог система и постављањем услова реакције, итд.

Избор квантитативних метода:

Квантитативне методе се деле на релативне квантитативне методе и апсолутне квантитативне методе.Релативна квантификација се може користити за откривање ефекта одређених метода лечења на експресију гена, откривање разлике у експресији гена у различито време и упоређивање разлике у експресији гена у различитим ткивима.Апсолутна квантификација може открити количину нуклеинске киселине у вирусу и тако даље.Када радимо експерименте, морамо изабрати одговарајуће квантитативне методе према сопственим експериментима.

Принципи дизајна прајмера:

Дизајн прајмера за кПЦР је директно повезан са ефикасношћу амплификације и специфичношћу производа.Стога је правилно дизајнирање добрих прајмера први корак успешног кПЦР-а.У дизајну прајмера треба обратити пажњу на следеће принципе када се испуњава принцип конвенционалног дизајна прајмера:

1. Дужина циљног фрагмента је контролисана између 100 и 300 бп;

2. Дизајн унакрсних ексона да би се избегао утицај геномске ДНК;

3. Дизајнирани прајмери ​​треба да се тестирају на ефикасност амплификације и тек када ефикасност амплификације достигне стандард (90-110%) могу се користити за квантитативне експерименте;

4. Концентрација прајмера се обично оптимизује између 0,1уМ и 1,0уМ.

ИзборРОКС:

У процесу квантитативне реакције, РОКС може равномерно да подеси разлику оптичке путање, грешку пипетирања или разлику у запремини узроковану испаравањем и кондензацијом, побољшавајући поновљивост резултата.Међутим, треба напоменути да је избор РОКС-а повезан са инструментом.Ако кПЦР инструмент има функцију аутоматског исправљања разлике између рупа, не мора да додаје РОКС;у супротном, треба додати РОКС корекцију.Мали партнери у куповини реагенса морају бити у складу са инструментом који се користи за одабир исправног РОКС-а, избегавајте касније грешке.

Припрема реакционог система:

Пожељне су реакционе запремине од 20 ул и 50 ул.Приликом формулисања система треба обратити пажњу на следеће ствари:

1. Реакциони систем треба припремити вентилацијом у ултра чистом радном столу, нови ддХ₂О се користи за сваки експеримент;

2. Сваки експеримент треба да припреми НТЦ да би проверио да ли постоји загађење у систему, а сваки пар прајмера треба да уради НТЦ приликом припреме система;

3. Да би се открило да ли постоји остатак гДНК у РНК шаблону, НРТ се може припремити за сваки узорак за детекцију;

4. Приликом припреме система препоручљиво је урадити најмање 3 техничка понављања за један узорак;

5. Када је шаблон цДНК, препоручује се разблаживање 5-10 пута да би се смањио инхибицијски ефекат система реверзне транскрипције на кПЦР експеримент.Боље је истражити количину шаблона по градијенту, тако да вредност ЦТ падне између 20-30;

6. Одредити потребан број реакција, повећати за 5-10% на основу броја реакција и израчунати конфигурациони број запремине;

7, систем се припрема по принципу премикса, мешањем након центрифугирања и осигурава да нема мехурића;

8, Што је више могуће да изаберете помоћни потрошни материјал.

Повезани РТ-кПЦР комплет