РТ-кПЦР је развијен од обичне ПЦР технологије.Он додаје флуоресцентне хемикалије (флуоресцентне боје или флуоресцентне сонде) традиционалном ПЦР реакционом систему и детектује ПЦР процес жарења и проширења у реалном времену према њиховим различитим луминисцентним механизмима.Промене флуоресцентног сигнала у медијуму се користе за израчунавање количине промене производа у сваком циклусу ПЦР.Тренутно, најчешће методе су метода флуоресцентне боје и метода сонде.

Метода флуоресцентне боје:
Неке флуоресцентне боје, као што су СИБР Греен Ⅰ, ПицоГреен, БЕБО, итд., не емитују светлост саме, већ емитују флуоресценцију након везивања за мањи жлеб дсДНК.Због тога, на почетку ПЦР реакције, машина не може да детектује флуоресцентни сигнал.Када реакција пређе на фазу продужетка жарења (метода у два корака) или фазе проширења (метода у три корака), двоструки ланци се отварају у овом тренутку, а нова ДНК полимераза Током синтезе ланца, флуоресцентни молекули се комбинују у мањем жлебу дсДНК и емитују флуоресценцију.Како се број ПЦР циклуса повећава, све више и више боја се комбинује са дсДНК, а флуоресцентни сигнал се такође континуирано повећава.Узмимо СИБР Греен Ⅰ као пример.
Метода сонде:
Такман сонда је најчешће коришћена сонда за хидролизу.На 5′ крају сонде налази се флуоресцентна група, обично ФАМ.Сама сонда је секвенца комплементарна циљном гену.На 3′ крају флуорофора постоји група за гашење флуоресцента.Према принципу преноса енергије флуоресцентне резонанце (Форстер резонантни пренос енергије, ФРЕТ), када репортерска флуоресцентна група (донорски флуоресцентни молекул) и гасећа флуоресцентна група (акцепторски флуоресцентни молекул) Када се ексцитациони спектар преклапа и удаљеност је веома блиска (7-10). молекула акцептора, док је аутофлуоресценција ослабљена.Стога, на почетку ПЦР реакције, када је сонда слободна и нетакнута у систему, репортерска флуоресцентна група неће емитовати флуоресценцију.Приликом жарења, прајмер и сонда се везују за шаблон.Током фазе екстензије, полимераза континуирано синтетише нове ланце.ДНК полимераза има 5′-3′ егзонуклеазну активност.Када стигне до сонде, ДНК полимераза ће хидролизовати сонду из шаблона, одвојити репортерску флуоресцентну групу од флуоресцентне групе гаситеља и ослободити флуоресцентни сигнал.Пошто постоји однос један-на-један између сонде и шаблона, метода сонде је супериорнија од методе бојења у смислу тачности и осетљивости теста.

Слика 1 Принцип кРТ-ПЦР

Дизајн прајмера
принципи:

Прајмери ​​треба да буду дизајнирани у очуваном региону серије нуклеинских киселина и да имају специфичност.

Најбоље је користити цДНК секвенцу, а мРНА секвенца је такође прихватљива.Ако није, сазнајте дизајн цдс региона ДНК секвенце.
Дужина флуоресцентног квантитативног производа је 80-150 бп, најдужа је 300 бп, дужина прајмера је углавном између 17-25 база, а разлика између узводног и низводног прајмера не би требало да буде превелика.

Садржај Г+Ц је између 40% и 60%, а најбоље је 45-55%.
Вредност ТМ је између 58-62 степена.
Покушајте да избегнете димере прајмера и самодимере, (не појављују се више од 4 пара узастопних комплементарних база) структура укоснице, ако је неизбежна, направите ΔГ<4,5кЈ/мол* Ако не можете да обезбедите да је гДНК уклоњена током реверзне транскрипције Чисто, најбоље је дизајнирати прајмере интрона, а крај интрона и Т регион не може да се избегне модификовани *3′ Ц, А/Г континуалне структуре (2-3) прајмера и не-
специфична Хомологија хетерогено амплификоване секвенце је пожељно мања од 70% или има 8 комплементарних базних хомологија.
База података:
ЦоттонФГД претрага по кључним речима
Дизајн прајмера:
Дизајн ИДТ-кПЦР прајмера

Слика 2 ИДТ страница са алатком за онлајн дизајн прајмера

Слика 3 Приказ странице резултата
Дизајн лнцРНА прајмера:
лнцРНА:исти кораци као мРНА.
миРНА:Принцип методе матичне петље: Пошто су све миРНК кратке секвенце од око 23 нт, директна ПЦР детекција се не може извршити, па се користи алатка секвенце матичне петље.Секвенца петље стабла је једноланчана ДНК од око 50 нт, која може сама да формира структуру укоснице.3 'Крај се може дизајнирати као секвенца комплементарна делимичном фрагменту миРНА, затим циљна миРНА може бити повезана са секвенцом петље стабла током реверзне транскрипције, а укупна дужина може да достигне 70бп, што је у складу са дужином амплификованог производа одређеном кПЦР-ом.Таилинг миРНА прајмер дизајн .
Детекција специфична за појачање:
База података о експлозијама на мрежи: ЦоттонФГД експлозија по сличности секвенце
Локална експлозија: Погледајте коришћење Бласт+ за локално експлозију, линук и мацос могу директно успоставити локалну базу података, вин10 систем се такође може урадити након инсталирања убунту басх-а.Креирајте локалну базу података о експлозијама и локалну експлозију;отворите убунту басх на вин10.
Напомена: планински памук и памук са морских острва су тетраплоидне културе, тако да ће резултат експлозије често бити два или више подударања.У прошлости, коришћење НАУ ЦД-а као базе података за извођење експлозије вероватно ће пронаћи два хомологна гена са само неколико СНП разлика.Обично се два хомологна гена не могу раздвојити дизајном прајмера, тако да се третирају као исти.Ако постоји очигледан индел, прајмер се обично дизајнира на инделу, али то може довести до секундарне структуре прајмера. Слободна енергија постаје већа, што доводи до смањења ефикасности амплификације, али то је неизбежно.

Детекција секундарне структуре прајмера:
Кораци:отвори олиго 7 → унеси секвенцу шаблона → затвори подпрозор → сачувај → лоцирај прајмер на шаблону, притисните цтрл+Д да подесиш дужину прајмера → анализирај различите секундарне структуре, као што су самодимеризационо тело, хетеродимер, укосница, неусклађеност, итд. Последње две слике на слици 4 су резултати теста прајмера.Резултат предњег прајмера је добар, нема очигледне структуре димера и укоснице, нема континуираних комплементарних база, а апсолутна вредност слободне енергије је мања од 4,5, док задњи прајмер показује континуирано 6 база су комплементарне, а слободна енергија је 8,8;поред тога, на 3′ крају се појављује озбиљнији димер, а појављује се и димер од 4 узастопне базе.Иако слободна енергија није висока, 3′ димер Цхл може озбиљно утицати на специфичност амплификације и ефикасност амплификације.Поред тога, потребно је проверити да ли има укосница, хетеродимера и неподударања.

Слика 3 резултати детекције олиго7
Детекција ефикасности појачања:
Ефикасност амплификације ПЦР реакције озбиљно утиче на резултате ПЦР.Такође у кРТ-ПЦР, ефикасност амплификације је посебно важна за квантитативне резултате.Уклоните друге супстанце, машине и протоколе у ​​реакционом пуферу.Квалитет прајмера такође има велики утицај на ефикасност амплификације кРТ-ПЦР.Да би се осигурала тачност резултата, и квантификација релативне флуоресценције и квантификација апсолутне флуоресценције треба да открију ефикасност амплификације прајмера.Препознато је да је ефективна ефикасност кРТ-ПЦР амплификације између 85% и 115%.Постоје две методе:
1. Стандардна метода криве:
а.Помешати цДНК
б.Градијентно разблаживање
ц.кПЦР
д.Једначина линеарне регресије за израчунавање ефикасности појачања
2. ЛинРегПЦР
ЛинРегПЦР је програм за анализу РТ-ПЦР података у реалном времену, који се такође називају квантитативни ПЦР (кПЦР) подаци засновани на СИБР Греен или сличној хемији.Програм користи податке који нису кориговани на основу основне линије, врши корекцију основне линије на сваком узорку одвојено, одређује прозор линеарности и затим користи линеарну регресиону анализу да уклопи праву линију кроз ПЦР скуп података.Из нагиба ове линије израчунава се ПЦР ефикасност сваког појединачног узорка.Средња ПЦР ефикасност по ампликону и вредност Цт по узорку се користе за израчунавање почетне концентрације по узорку, изражене у произвољним јединицама флуоресценције.Унос и излаз података се врши преко Екцел табеле.Само узорак
мешање је потребно, без градијента
потребни су кораци:(Узмите Боле ЦФКС96 као пример, не баш машину са јасним АБИ)
експеримент:то је стандардни кПЦР експеримент.
кПЦР излаз података:ЛинРегПЦР може да препозна два облика излазних датотека: РДМЛ или квантификациони резултат амплификације.У ствари, то је вредност детекције у реалном времену броја циклуса и сигнала флуоресценције од стране машине, а појачање се добија анализом вредности промене флуоресценције ефикасности линеарног сегмента.
Избор података: У теорији, РДМЛ вредност би требало да буде употребљива.Процењује се да је проблем мог рачунара то што софтвер не може да препозна РДМЛ, па имам излазну вредност екцел као оригиналне податке.Препоручује се да се прво изврши груба провера података, као што је неуспех при додавању узорака, итд. Тачке се могу избрисати у излазним подацима (наравно, не можете их избрисати, ЛинРегПЦР ће занемарити ове тачке у каснијој фази)

Слика 5 кПЦР извоз података

Слика 6 избор узорака кандидата

Унос података:Отворите квалификационе резултате амплификације.клс, → отворите ЛинРегПЦР → фајл → прочитајте из екцела → изаберите параметре као што је приказано на слици 7 → ОК → кликните на одреди основне линије

Слика 7 корака уноса линРегПЦР података

резултат:Ако нема понављања, није потребно груписање.Ако постоји понављање, груписање се може уредити у груписању узорака, а име гена се уноси у идентификатор, а затим ће исти ген бити аутоматски груписан.На крају, кликните на датотеку, извезите екцел и погледајте резултате.Ефикасност амплификације и резултати Р2 за сваки бунар ће бити приказани.Друго, ако се поделите у групе, биће приказана исправљена просечна ефикасност појачања.Уверите се да је ефикасност амплификације сваког прајмера између 85% и 115%.Ако је превелика или премала, то значи да је ефикасност прајмера слаба.

Слика 8 Резултат и излаз података

Експериментални процес:
Захтеви за квалитет РНК:
чистоћа:1.72.0 указује да може постојати резидуални изотиоцијанат.Чиста нуклеинска киселина А260/А230 треба да буде око 2. Ако постоји јака апсорпција на 230 нм, то указује да постоје органска једињења као што су фенат јони.Поред тога, може се открити електрофорезом у 1,5% агарозном гелу.Поставите маркер, јер ссРНА нема денатурацију и логаритам молекулске тежине нема линеарну везу, а молекулска тежина се не може тачно изразити.Концентрација: Теоретскинемање од 100нг/ул, ако је концентрација прениска, чистоћа је генерално ниска, а не висока

Слика 9 РНК гел

Поред тога, ако је узорак драгоцен и концентрација РНК је висока, препоручује се да се након екстракције подели аликвот и РНК разблажи до коначне концентрације од 100-300 нг/ул за реверзну транскрипцију.Инпроцес реверзне транскрипције, када се мРНА транскрибује, олиго (дт) прајмери ​​који се могу специфично везати за полиА репове се користе за реверзну транскрипцију, док лнцРНА и цирцРНА користе насумичне хексамер (Рандом 6 мер) прајмере за реверзну транскрипцију укупне РНК.Многе компаније су сада лансирале посебне комплете за праћење.За методу матичне петље, метода таилинг је погоднија, има високу пропусност и штеди реагенсе, али ефекат разликовања миРНА из исте породице не би требало да буде тако добар као метода матичне петље.Сваки комплет за реверзну транскрипцију има захтеве за концентрацију ген-специфичних прајмера (стем-лоопс).Интерна референца која се користи за миРНА је У6.У процесу инверзије стабљике и петље, епрувету У6 треба одвојено преокренути, а предњи и задњи прајмер У6 треба директно додати.И цирцРНА и лнцРНА могу користити ХКГ као интерну референцу.ИнцДНК детекција,
ако нема проблема са РНК, цДНК би такође требало да буде у реду.Међутим, ако се тежи савршенству експеримента, најбоље је користити интерни референтни ген (Референтни ген, РГ) који може разликовати гДНК од ЦД-а.Генерално, РГ је ген за одржавање куће., ХКГ) као што је приказано на слици 10;У то време сам правио протеин за складиштење од соје и користио интроне који садрже актин7 као интерну референцу.Величина амплификованог фрагмента овог прајмера у гДНК била је 452 бп, а ако је цДНК коришћен као шаблон, била је 142 бп.Затим су резултати теста открили да је део цДНК заправо контаминиран гДНК, а такође је доказано да нема проблема са резултатом реверзне транскрипције, и да се може користити као шаблон за ПЦР.Бескорисно је изводити електрофорезу агарозног гела директно са цДНК, а то је дифузна трака, што није убедљиво.

Слика 10 Детекција цДНК

Одређивање кПЦР условагенерално није проблем према протоколу комплета, углавном у кораку тм вредности.Ако неки прајмери ​​нису добро дизајнирани током дизајна прајмера, што доводи до велике разлике између вредности тм и теоретских 60°Ц, препоручује се да цДНК Након што су узорци помешани, изврши градијентни ПЦР са прајмерима и покуша да избегне подешавање температуре без трака као ТМ вредности.

Анализа података

Конвенционална метода квантитативне ПЦР обраде релативне флуоресценције је у основи према 2-ΔΔЦТ.Шаблон за обраду података.

Сродни производи:

ПЦР у реалном времену једноставно^TM –Такман

ПЦР у реалном времену једноставно^TM –СИБР ЗЕЛЕНИ И

РТ Еаси И (Мастер Премик за синтезу првог ланца цДНК)

РТ Еаси ИИ (Мастер Премик за синтезу првог ланца цДНК за кПЦР)