Почетни материјал: РНК
ПЦР квантитативне реверзне транскрипције (РТ-кПЦР) је експериментална метода која се користи у ПЦР експериментима користећи РНК као почетни материјал.У овој методи, укупна РНК или РНК (мРНК) се прво транскрибује у комплементарну ДНК (цДНК) помоћу реверзне транскриптазе.Затим је изведена кПЦР реакција коришћењем цДНК као шаблона.РТ-кПЦР се користи у разним апликацијама молекуларне биологије, укључујући анализу генске експресије, валидацију РНК интерференције, валидацију микромрежа, детекцију патогена, генетско тестирање и истраживање болести.
Методе у једном и два корака за РТ-кПЦР
РТ-кПЦР се може постићи методом у једном или два корака.РТ-кПЦР у једном кораку комбинује реверзну транскрипцију и ПЦР амплификацију, омогућавајући реверзној транскриптази и ДНК полимерази да заврше реакцију у истој епрувети под истим условима пуфера.РТ-кПЦР у једном кораку захтева само употребу прајмера специфичних за секвенцу.У РТ-кПЦР у два корака, реверзна транскрипција и ПЦР амплификација се изводе у две епрувете, користећи различите оптимизоване пуфере, реакционе услове и стратегије дизајна прајмера.
| Предност | Недостатак | |
| Један корак | Ова метода има мање експерименталне грешке јер се обе реакције обављају у једној епрувети
Мање корака пипетирања смањује ризик од контаминације
Погодно за високо пропусно појачање/скрининг, брзо и поновљиво | Реакције у два корака не могу се оптимизовати одвојено
Пошто су услови реакције компромитовани комбиновањем реакције у два корака, осетљивост није тако добра као код методе у два корака
Број мета које детектује један узорак је мали |
| Два корака | Способност креирања стабилних цДНК библиотека које се могу чувати у дужем временском периоду и користити у више реакција
Циљни гени и референтни гени могу се амплифицирати из исте цДНК библиотеке без потребе за више библиотека цДНК
Реакциони пуфери и реакциони услови који омогућавају оптимизацију појединачних реакционих циклуса
Флексибилан избор услова окидача | Коришћење више епрувета и више корака пипетирања повећава ризик од контаминације ДНК, и дуготрајан.
Захтева више оптимизације него метода у једном кораку |
Сродни производи:
РТ-кПЦР Еасиᵀᴹ (Оне Степ)-СИБР Греен И
РТ-кПЦР Еасиᵀᴹ (Један корак)-Такман
РТ Еасиᵀᴹ И Мастер премикс за прву синтезу ЦДНА
Реал Тиме ПЦР Еасиᵀᴹ-СИБР Греен И Кит
ПЦР у реалном времену Еасиᵀᴹ-Такман
Избор укупне РНК и мРНК
Приликом дизајнирања РТ-кПЦР експеримента, важно је одлучити да ли ћете користити укупну РНК или пречишћену иРНК као шаблон за реверзну транскрипцију.Иако мРНА може бити у стању да обезбеди нешто већу осетљивост, укупна РНК се и даље често користи.Разлог за то је што укупна РНК има важнију предност као полазни материјал од мРНК.Прво, процес захтева мање корака пречишћавања, што обезбеђује бољи квантитативни опоравак шаблона и бољу нормализацију резултата на почетни број ћелија.Друго, избегава се корак обогаћивања мРНК, који може избећи могућност искривљених резултата због различитих опоравка различитих мРНК.Све у свему, пошто је у већини апликација релативна квантификација циљног гена важнија од апсолутне осетљивости детекције, укупна РНК је прикладнија у већини случајева.
Прајмер за реверзну транскрипцију
У методи у два корака, три различите методе се могу користити за прајмер цДНК реакције: олиго(дТ) прајмери, насумични прајмери или прајмери специфични за секвенцу.Типично, олиго(дТ) прајмери и насумични прајмери се користе у комбинацији.Ови прајмери се спајају са шаблоном иРНК ланца и обезбеђују реверзну транскриптазу са почетном тачком за синтезу.
| Избор прајмера | Структура и функција | Предност | Недостатак |
| Олиго(дТ) прајмер (или усидрени олиго(дТ) прајмер) | Проширено жарење на остатке тимина на поли(А) репу мРНА;сидрени олиго(дТ) прајмер садржи Г, Ц или А на 3′ крају (место сидрења) | Синтеза цДНК пуне дужине из мРНА са поли(А) репом
Применљиво када је доступно мање полазног материјала
Место сидрења обезбеђује да се олиго(дТ) прајмер везује за 5′ поли(А) реп мРНА | Погодно само за амплификацију гена са поли(А) реповима
Набавите цДНК скраћену са места прајминга*2 у поли(А)
Пристрасно да се веже за крај 3′*
*Ова могућност је минимизирана ако се користе усидрени олиго(дТ) прајмери |
| случајни прајмер
| 6 до 9 база у дужину, које могу да се причврсте на више места током транскрипције РНК | Спајање на све РНК (тРНК, рРНК и мРНК)
Погодно за транскрипте са значајном секундарном структуром, или када је доступно мање почетног материјала
Висок принос цДНК | цДНК се реверзно транскрибује са свих РНК, што обично није пожељно и може разблажити сигнал циљне мРНА
добити скраћену цДНК |
| прајмери специфични за секвенцу | Прилагођени прајмери који циљају специфичне секвенце мРНА | специфична библиотека цДНК
Побољшајте осетљивост
Коришћење реверзних кПЦР прајмера | Ограничено само на синтезу једног циљног гена |
Реверзне транскриптазе
Реверзна транскриптаза је ензим који користи РНК за синтезу ДНК.Неке реверзне транскриптазе имају активност РНКазе и могу деградирати РНК ланце у хибридним ланцима РНК-ДНК након транскрипције.Ако нема ензимску активност РНазе, може се додати РНасеХ за већу ефикасност кПЦР.Уобичајено коришћени ензими укључују реверзну транскриптазу Молонеи мишје леукемије вируса и реверзну транскриптазу вируса мијелобластома птица.За РТ-кПЦР идеално је изабрати реверзну транскриптазу са већом термостабилношћу, тако да се синтеза цДНК може извршити на вишим температурама, обезбеђујући успешну транскрипцију РНК са вишом секундарном структуром, уз одржавање њихове пуне активности током целе реакције, што резултира већим приносима цДНК.
Сродни производи:
Фореаси М-МЛВ реверзна транскриптаза
РНасе Х активност реверзне транскриптазе
РНасеХ је у стању да разгради РНК ланце од РНК-ДНК дуплекса, омогућавајући ефикасну синтезу дволанчане ДНК.Међутим, када се користи дуга мРНА као шаблон, РНК се може прерано разградити, што резултира скраћеном цДНК.Стога је често корисно минимизирати активност РНасеХ током клонирања цДНК ако се жели синтеза дугих транскрипата.Насупрот томе, реверзне транскриптазе са активношћу РНазе Х често су корисне за кПЦР апликације јер побољшавају топљење РНК-ДНК дуплекса током првог циклуса ПЦР-а.
Дизајн прајмера
ПЦР прајмери који се користе за кПЦР корак у РТ-кПЦР идеално би требало да буду дизајнирани да обухватају ексон-екзон спој, где би прајмер за амплификацију потенцијално могао да обухвати стварну границу ексон-интрон.Пошто секвенце геномске ДНК које садрже интрон нису амплифициране, овај дизајн смањује ризик од помножавања лажних позитивних резултата од контаминације геномске ДНК.
Ако се прајмери не могу дизајнирати да одвајају егзоне или границе ексон-ексона, можда ће бити неопходно третирати узорке РНК са ДНазом И или дсДНазом без РНК да би се уклонила контаминација геномске ДНК.
РТ-кПЦР контрола
Негативна контрола реверзне транскрипције (-РТ контрола) треба да буде укључена у све РТ-кПЦР експерименте да би се открила контаминација ДНК (као што је геномска ДНК или ПЦР производи из претходних реакција).Ова контрола садржи све компоненте реакције осим реверзне транскриптазе.Пошто се реверзна транскрипција не дешава са овом контролом, ако се примети ПЦР амплификација, контаминација из ДНК је највероватније.
Време поста: 02.08.2022
