Флуоресцентни квантитативни ПЦР (такође познат као ТакМан ПЦР, у даљем тексту ФК-ПЦР) је нова квантитативна технологија нуклеинске киселине коју је развио ПЕ (Перкин Елмер) у Сједињеним Државама 1995. Ова технологија је заснована на конвенционалном ПЦР додавањем флуоресцентно обележених сонди.У поређењу са флексибилним ПЦР-ом, ФК-ПЦР има много предности за реализацију своје квантитативне функције.Овај чланак намерава да укратко опише карактеристике, принципе, методе и примене технологије.

1 Карактеристике

ФК-ПЦР не само да има високу осетљивост обичног ПЦР-а, већ и због примене флуоресцентних сонди, може директно детектовати промену флуоресцентног сигнала током ПЦР амплификације кроз систем фотоелектричне проводљивости да би се добили квантитативни резултати, који превазилазе многе недостатке конвенционалног ПЦР-а, тако да такође има високу специфичност ДНК-а и високу специфичност ДНК-хибрроскопије.

На пример, опште ПЦР производе треба посматрати електрофорезом агарозног гела и бојењем етидијум бромидом ултраљубичастом светлошћу или електрофорезом полиакриламидног гела и бојењем сребром.Ово не само да захтева више инструмената, већ захтева и време и труд.Мрље које се користе Етидијум бромид су штетне за људско тело, а ове компликоване експерименталне процедуре пружају могућност загађивања и лажних позитивних резултата.Међутим, ФК-ПЦР треба само једном да отвори поклопац током пуњења узорка, а следећи процес је потпуно затворена епрувета, која не захтева накнадну обраду ПЦР-а, избегавајући многе недостатке у конвенционалним ПЦР операцијама.Експеримент генерално користи АБИ7100 ПЦР термални циклус који је развила ПЕ компанија.

Инструмент има следеће карактеристике: ① Широка примена: Може се користити за квантификацију ДНК и РНК ПЦР производа, истраживање експресије гена, детекцију патогена и оптимизацију ПЦР услова.② Јединствени квантитативни принцип: Коришћењем флуоресцентно обележених сонди, количина флуоресценције ће се акумулирати са ПЦР циклусом након ласерске ексцитације, како би се постигла сврха квантификације.③ Висока радна ефикасност: Уграђени 9600 ПЦР термални циклус, компјутерски контролисан 1 до 2 сата да се заврши амплификација и квантификација 96 узорака аутоматски и синхроно.④ Нема потребе за гел електрофорезом: Нема потребе за разблаживањем и електрофорезом узорка, само користите специјалну сонду за детекцију директно у реакционој цеви.⑤Без загађења у цевоводу: Усвојена је јединствена потпуно затворена реакциона цев и фотоелектрични проводни систем, тако да нема потребе да бринете о загађењу.⑥Резултати су поновљиви: квантитативни динамички опсег је до пет редова величине.Стога, пошто је ова технологија успешно развијена, цењена је од стране многих научних истраживача и примењивана је у многим областима.

2 Принципи и методе

Принцип рада ФК-ПЦР-а је коришћење 5′→3′ егзонуклеазне активности Так ензима за додавање флуоресцентно обележене сонде у ПЦР реакциони систем.Сонда може специфично да се хибридизује са ДНК шаблоном садржаним у секвенци прајмера.5′крај сонде је обележен флуоресцентним емисионим геном ФАМ (6-карбоксифлуоресцеин, пик емисије флуоресценције на 518нм), а 3′крај је обележен са Тхе флуоресценце куенцхинг гроуп ТАМРА (6-карбокситетраметилемисија флуоресцеин 5′ ) уметак сонде је фосфорилисан како би се спречило да се сонда продужи током ПЦР амплификације.Када сонда остане нетакнута, група за гашење потискује емисију флуоресценције групе која емитује.Када се емитујућа група одвоји од групе за гашење, инхибиција се поништава, а оптичка густина на 518 нм се повећава и детектује је помоћу система за детекцију флуоресценције. У фази ренатурације, сонда се хибридизује са ДНК шаблона, а Так ензим у фази екстензије прајмера се креће дуж ДНК прајмера.Када је сонда прекинута, ефекат гашења се ослобађа и флуоресцентни сигнал се ослобађа.Сваки пут када се шаблон копира, сонда се одсече, праћено ослобађањем флуоресцентног сигнала.Пошто постоји однос један-на-један између броја ослобођених флуорофора и броја ПЦР производа, ова техника се може користити за прецизну квантификацију шаблона.Експериментални инструмент углавном користи термални циклус АБИ7100 ПЦР који је развила ПЕ компанија, а могу се користити и други термални циклуси.Ако се за експеримент користи реакциони систем типа АБИ7700, по завршетку реакције, квантитативни резултати се могу директно дати путем компјутерске анализе.Ако користите друге термоциклере, потребно је да користите детектор флуоресценције за мерење сигнала флуоресценције у реакционој цеви у исто време да бисте израчунали РК+, РК-, △РК.РК+ представља однос интензитета луминесценције флуоресцентне емисионе групе епрувете са узорком и интензитета луминисценције групе за гашење, РК- представља однос два у празној епрувети, △РК (△РК=РК+-РК-) представља количину података флуоресцентне обраде, након што се резултати промене флуора могу добити након обраде флуора.Увођењем флуоресцентних сонди значајно је побољшана специфичност експеримента.Дизајн сонде генерално треба да испуњава следеће услове: ①Дужина сонде треба да буде око 20-40 база да би се обезбедила специфичност везивања.②Садржај ГЦ база је између 40% и 60% да би се избегло дуплирање појединачних нуклеотидних секвенци.③ Избегавајте хибридизацију или преклапање са прајмерима.④ Стабилност везивања између сонде и шаблона је већа од стабилности везивања између прајмера и шаблона, тако да Тм вредност сонде треба да буде најмање 5°Ц виша од Тм вредности прајмера.Поред тога, концентрација сонде, хомологија између сонде и шаблонске секвенце и растојање између сонде и прајмера имају утицај на експерименталне резултате.

Сродни производи:

Кина Лнц-РТ Хероᵀᴹ И(са гДНазом)(супер премикс за синтезу првог ланца цДНК из лнцРНА) Произвођач и добављач |Форегене (фореивд.цом)

Цхина Реал Тиме ПЦР Еасиᵀᴹ-Такман Мануфацтурер анд Супплиер |Форегене (фореивд.цом)