Добро је познато да је у централној догми РНК транскрипциони посредник између експресије ДНК и протеина.У поређењу са детекцијом ДНК, детекција РНК може објективније да одражава експресију гена у организмима.Експерименти који укључују РНК укључују: кРТ-ПЦР, РНА-Сек и детекцију фузионих гена, итд. На основу карактеристика саме РНК (шећерни прстен РНК има једну слободну хидроксилну групу више од шећерног прстена ДНК), у комбинацији са великим бројем РНКаза у окружењу, РНК је нестабилнија и лакша за разградњу.Смеће унутра, смеће напоље, ако квалитет РНК није добар, онда експериментални резултати морају бити незадовољавајући, посебно манифестовани као нетачни подаци или лоша поновљивост.Због тога треба више пажње посветити обради РНК, а важнија је и веза контроле квалитета да би се обезбедила прецизност и тачност накнадних експерименталних података.

За контролу квалитета РНК генерално постоје следеће најчешће коришћене методе:

• Спектрофотометрија
• електрофореза у агарозном гелу
• Агилент Биоанализер
• флуоресцентни квантитативни ПЦР у реалном времену
• Кубит метода флуоресцентне боје

01 Спектрофотометрија

РНК има коњуговане двоструке везе и има апсорпциони врх на таласној дужини од 260 нм.Према Ламберт-Бееровом закону, можемо израчунати концентрацију РНК из апсорпционог врха на 260нм.Поред тога, можемо израчунати и чистоћу РНК према односу апсорпционих врхова од 260 нм, 280 нм и 230 нм.280 нм и 230 нм су врхови апсорпције протеина и малих молекула, респективно.Однос А260/А280 и А260/А230 квалификоване чистоће РНК треба да буде већи од 2. Ако је мањи од 2, то значи да постоји контаминација протеином или малим молекулима у узорку РНК и да треба поново да се пречисти.Извори контаминације ће утицати на низводне експерименте, као што је инхибирање ефикасности амплификације ПЦР реакција, што резултира нетачним квантитативним резултатима.Чистоћа РНК има велики утицај на накнадне резултате, тако да је спектрофотометрија генерално незаменљива карика контроле квалитета у првом кораку у експериментима са нуклеинским киселинама.

Слика 1. Типични спектар апсорпције РНК/ДНК

02 Електрофореза у агарозном гелу

Поред чистоће, интегритет РНК је и један од важних показатеља за процену квалитета РНК.Деградација РНК ће довести до великог броја кратких фрагмената у узорку, тако да ће се смањити број фрагмената РНК који се могу ефикасно детектовати и покрити референтном секвенцом.Интегритет РНК се може проверити електрофорезом укупне РНК на 1% агарозном гелу.Овим методом можете сами да конфигуришете гел или користите префабриковани Е-Гел™ систем за тестирање интегритета.Више од 80% укупне РНК је рибозомална РНК, од којих се већина састоји од 28С и 18С рРНК (у системима сисара).РНК доброг квалитета ће показати две очигледне светле траке, а то су 28С и 18С светле траке, респективно, на 5 Кб и 2 Кб, а однос ће тежити да буде близу 2:1.Ако је у дифузном стању, то значи да је узорак РНК можда деградиран и препоручује се коришћење методе описане касније за даље испитивање квалитета РНК.

Слика 2. Поређење деградиране (трака 2) и интактне РНК (трака 3) на електрофорези у агарозном гелу

03 Агилент Биоанализер

Поред горе описане методе електрофорезе у агарозном гелу, која нам може помоћи да једноставно и брзо идентификујемо интегритет РНК, такође можемо користити Агилент биоанализатор за одређивање интегритета РНК.Користи комбинацију микрофлуидике, капиларне електрофорезе и флуоресценције за процену концентрације и интегритета РНК.Коришћењем уграђеног алгоритма за анализу профила узорка РНК, Агилент биоанализатор може израчунати референтну вредност интегритета РНК, РНК Интегрити Нумбер (у даљем тексту РИН) [1].Што је већа вредност РИН, то је већи интегритет РНК (1 је изузетно деградиран, 10 је најпотпунији).Неки експерименти који укључују РНК предлажу коришћење РИН-а као параметра за процену квалитета.Узимајући као пример експерименте секвенционирања високе пропусности (у даљем тексту НГС), смернице Онцомине™ хуманог имунолошког репертоара, које се користе за детекцију рецептора антигена Б ћелија и Т ћелија у серији панела Тхермо Фисхер'с Онцомине, сугеришу да се узорци са вредностима РИН већим од 4, могу мерити ефикаснија очитавања 3 (слика 3).Постоје различити препоручени распони за различите панеле, а често већи РИН може донети ефикасније податке.

Слика 3, у експериментима Онцомине™ Хуман Иммуне Репертоире, узорци са РИН већим од 4 могу открити ефикасније читање и клонове Т ћелија.【2】

Међутим, РИН вредност такође има нека ограничења.Иако РИН има високу корелацију са квалитетом НГС експерименталних података, није погодан за ФФПЕ узорке.ФФПЕ узорци су хемијски третирани дуго времена, а екстрахована РНК генерално има релативно ниску РИН вредност.Међутим, то не значи да ефективни подаци експеримента морају бити незадовољавајући.Да бисмо прецизно проценили квалитет ФФПЕ узорака, морамо да користимо мере које нису РИН.Поред РИН-а, Агилент биоанализер такође може израчунати вредност ДВ200 као параметар за процену квалитета РНК.ДВ200 је параметар који израчунава пропорцију фрагмената већих од 200 бп у узорку РНК.ДВ200 је бољи показатељ квалитета узорка ФФПЕ од РИН-а.За РНК екстраховану помоћу ФФПЕ, она има веома високу корелацију са бројем гена који се могу ефикасно детектовати и разноврсношћу гена [3].Иако ДВ200 може да надокнади недостатке у детекцији квалитета ФФПЕ, Агилент биоанализатор још увек не може свеобухватно да анализира проблеме квалитета у узорцима РНК, укључујући да ли у узорцима постоје инхибитори.Сами инхибитори могу утицати на ефикасност амплификације експеримената у наставку и смањити количину корисних података.Да бисмо знали да ли постоји инхибитор у узорку, можемо усвојити флуоресцентну квантитативну ПЦР методу у реалном времену описану у наставку.

04 флуоресцентни квантитативни ПЦР у реалном времену

Флуоресцентна квантитативна ПЦР метода у реалном времену може не само да открије инхибиторе у узорку, већ и тачно одражава квалитет РНК у ФФПЕ узорку.У поређењу са Агилент биолошким анализаторима, квантитативни инструменти за флуоресценцију у реалном времену су популарнији у великим биолошким лабораторијама због њихове шире примене.Да бисмо тестирали квалитет узорака РНК, потребно је само да купимо или припремимо прајмер сонде за интерне референтне гене, као што је ГУСБ (кат бр. Хс00939627).Коришћењем овог скупа прајмера, сонди и стандарда (укупна РНК познате концентрације) за извођење апсолутних квантитативних експеримената, ефективна концентрација фрагмената РНК се може израчунати као стандард за процену квалитета РНК (скраћено Функционална РНК квантитација (ФРК)).У НГС тесту, открили смо да ФРК узорака РНК има веома високу корелацију са ефективним обимом података.За све узорке веће од 0,2 нг/уЛ ФРК, најмање 70% очитавања може ефикасно да покрије референтну секвенцу (слика 4).

На слици 4, вредност ФРК детектована квантитативном методом флуоресценције има веома високу корелацију (Р2>0,9) са ефективним подацима добијеним у НГС експерименту.Црвена линија је ФРК вредност једнака 0,2 нг/уЛ (лог10 = -0,7).【4】

Поред тога што је применљива на ФФПЕ узорке, квантитативна ПЦР метода у реалном времену такође може ефикасно пратити инхибиторе у узорцима.Можемо додати узорак који треба да се детектује у реакциони систем помоћу интерне позитивне контроле (ИПЦ) и његовог теста, а затим извршимо квантификацију флуоресценције да бисмо добили Цт вредност.Ако вредност Цт заостаје за вредношћу Цт у реакцији без узорка, то указује да је инхибитор присутан у узорку и инхибира ефикасност амплификације у реакцији.

05 Кубит метода флуоресцентне боје

Кубит Флуорометер је најчешће коришћени мали уређај за детекцију концентрације нуклеинских киселина и чистоће, који је лак за руковање и постоји у скоро свакој лабораторији за молекуларну биологију.Он прецизно израчунава концентрацију нуклеинске киселине откривањем и флуоресцентном бојом која везује нуклеинску киселину (Кубит детецтион реагенс).Кубит има високу осетљивост и специфичност и може прецизно квантификовати РНК до концентрације пг/µЛ.Поред добро познате способности прецизног квантификације концентрације нуклеинске киселине, најновији нови модел Тхермо Фисхер-а, Кубит 4.0, такође може открити интегритет РНК.Кубит 4.0 систем за детекцију РНК (РНА ИК тест) детектује интегритет РНК истовремено откривајући две специфичне флуоресцентне боје.Ове две флуоресцентне боје могу да се вежу за велике фрагменте и мале фрагменте РНК, респективно.Ове две флуоресцентне боје указују на пропорцију великих фрагмената РНК у узорку, а из тога се може израчунати ИК (Интегритет и квалитет) вредност која представља квалитет РНК.Вредност ИК је применљива и на ФФПЕ и на не-ФФПЕ узорке, и има велики утицај на накнадни квалитет секвенцирања.Узимајући НГС експерименте као пример, у РНА-Сек тест експериментима изведеним на Ион торрент™ платформи, већина узорака са вредностима ИК већим од 4 имала је најмање 50% ефективних очитавања (Слика 5).У поређењу са горе наведеним методама детекције, Кубит ИК Ассаи не само да је погоднији за рад и траје мање времена (унутар пет минута), већ има и велику корелацију између измерене вредности ИК параметра и квалитета података низводних експеримената.

На слици 5, постоји велика корелација између Кубит РНК ИК вредности и мапираних очитавања РНА-Сек.【5】

Кроз горњи увод, верујем да сви имају довољно разумевања о различитим методама контроле квалитета РНК.У пракси, можете биратиодговарајућу методу према типу узорка и постојећим инструментима.Само добром контролом квалитета РНК можемо избећи неуспех наредних експеримената узрокован лошим квалитетом узорка, чиме ћемо уштедети драгоцено време, енергију и трошкове.

Референтни производи:

Комплет за изолацију укупне РНК животиња

Комплет за изолацију укупне РНК ћелија

референце

【1】Сцхроедер, А., Муеллер, О., Стоцкер, С. ет ал.РИН: број интегритета РНК за додељивање вредности интегритета мерењима РНК.БМЦ Молецулар Биол 7, 3 (2006).хттпс:// дои .орг/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Онцомине Хуман Иммуне Репертоар Усер Гуиде (Пуб. Но. МАН0017438 Рев. Ц.0).

【3】Леах Ц Вехмас, Цхарлес Е Воод, Бриан Н Цхорлеи, Цароле Л Иаук, Гаил М Нелсон, Сусан Д Хестер, Побољшане метрике квалитета за процјену РНК изведене из архивских формалином фиксираних парафинских узорака ткива, Узорци ткива уметнутих у парафин, Волуме1930, Токсиколошке науке19, Токсиколошке науке10 57–373,хттпс://дои.орг/10.1093/токсци/