Нема појачања сигнала

1.Так ДНК полимераза у комплету губи своју активност због неправилног складиштења или истека комплета.
Препорука: Потврдите услове складиштења комплета;поново додајте одговарајућу количину Так ДНК полимеразе у ПЦР систем или купите нови комплет за ПЦР у реалном времену за повезане експерименте.

2. Постоји много инхибитора Так ДНК полимеразе у ДНК шаблону.
Предлог: Пречистите шаблон или смањите количину коришћеног шаблона.

3. Концентрација Мг2+ није погодна.
Препорука: Концентрација Мг2+ у 2× Реал ПЦР мешавини коју пружамо је 3,5 мМ.Међутим, за неке посебне прајмере и шаблоне, концентрација Мг2+ може бити већа.Због тога можете директно додати МгЦл2 да бисте оптимизовали концентрацију Мг2+.Препоручује се повећање Мг2+ за 0,5мМ сваки пут ради оптимизације.

4. Услови ПЦР амплификације нису прикладни, а секвенца прајмера или концентрација је неодговарајућа.
Предлог: потврдите исправност секвенце прајмера и прајмер није деградиран;ако сигнал појачања није добар, покушајте да смањите температуру жарења и на одговарајући начин подесите концентрацију прајмера.

5. Количина шаблона је премала или превелика.
Препорука: Извршите разблаживање градијентом линеаризације шаблона и изаберите концентрацију шаблона са најбољим ПЦР ефектом за ПЦР експеримент у реалном времену.

НТЦ има превисоку вредност флуоресценције

1. Контаминација реагенсом током рада.
Препорука: Замените новим реагенсима за ПЦР експерименте у реалном времену.

2. До контаминације је дошло током припреме ПЦР реакционог система.
Препорука: Предузмите неопходне заштитне мере током рада, као што су: ношење рукавица од латекса, употреба врха пипете са филтером итд.

3. Прајмери ​​су деградирани, а деградација прајмера ће изазвати неспецифично појачање.
Предлог: Користите СДС-ПАГЕ електрофорезу да откријете да ли су прајмери ​​деградирани и замените их новим прајмерима за ПЦР експерименте у реалном времену.

Димер прајмера или неспецифична амплификација

1. Концентрација Мг2+ није погодна.
Препорука: Концентрација Мг2+ у 2× Реал ПЦР ЕасиТМ мешавини коју пружамо је 3,5 мМ.Међутим, за неке посебне прајмере и шаблоне, концентрација Мг2+ може бити већа.Због тога можете директно додати МгЦл2 да бисте оптимизовали концентрацију Мг2+.Препоручује се повећање Мг2+ за 0,5мМ сваки пут ради оптимизације.

2. Температура ПЦР жарења је прениска.
Предлог: Сваки пут повећајте температуру ПЦР жарења за 1℃ или 2℃.

3. ПЦР производ је предугачак.
Препорука: Дужина ПЦР производа у реалном времену треба да буде између 100-150бп, не више од 500бп.

4. Прајмери ​​су деградирани, а деградација прајмера ће довести до појаве специфичне амплификације.
Предлог: Користите СДС-ПАГЕ електрофорезу да откријете да ли су прајмери ​​деградирани и замените их новим прајмерима за ПЦР експерименте у реалном времену.

5. ПЦР систем је неисправан или је систем премали.
Предлог: ПЦР реакциони систем је премали што ће довести до смањења тачности детекције.Најбоље је користити реакциони систем који препоручује квантитативни ПЦР инструмент за поновно покретање ПЦР експеримента у реалном времену.

Слаба поновљивост квантитативних вредности

1. Инструмент је неисправан.
Предлог: Може постојати грешке између сваког ПЦР отвора на инструменту, што доводи до лоше поновљивости током управљања температуром или детекције.Проверите према упутствима одговарајућег инструмента.

2. Чистоћа узорка није добра.
Препорука: Нечисти узорци ће довести до лоше поновљивости експеримента, што укључује чистоћу шаблона и прајмера.Најбоље је поново пречистити шаблон, а прајмери ​​се најбоље пречишћавају помоћу СДС-ПАГЕ.

3. Време припреме и складиштења ПЦР система је предуго.
Предлог: Користите ПЦР систем у реалном времену за ПЦР експеримент одмах након припреме и не остављајте га предуго по страни.

4. Услови ПЦР амплификације нису прикладни, а секвенца прајмера или концентрација је неодговарајућа.
Предлог: потврдите исправност секвенце прајмера и прајмер није деградиран;ако сигнал појачања није добар, покушајте да смањите температуру жарења и на одговарајући начин подесите концентрацију прајмера.

5. ПЦР систем је неисправан или је систем премали.
Предлог: ПЦР реакциони систем је премали што ће довести до смањења тачности детекције.Најбоље је користити реакциони систем који препоручује квантитативни ПЦР инструмент за поновно покретање ПЦР експеримента у реалном времену.