Стерилизација врхова пипета и ЕП епрувета итд.

1. Припремите 0,1% (хиљадити) ДЕПЦ (високо токсична супстанца) са дејонизованом водом, пажљиво га употребите у хауби и чувајте на 4°Ц даље од светлости;

ДЕПЦ вода је чиста вода третирана ДЕПЦ-ом и стерилисана високом температуром и високим притиском.Тестирано да не садржи РНКазу, ДНазу и протеиназу.

2. Ставите врх пипете и ЕП епрувету у 0,1% ДЕПЦ и уверите се да су врх пипете и ЕП епрувета напуњени са 0,1% ДЕП.

3. Заштитити од светлости, оставити да одстоји преко ноћи (12-24х)

4. Кутија која садржи врх и ЕП цев не мора да се натапа у ДЕПЦ.Након што сте грубо уклонили ДЕПЦ воду из врха или ЕП цеви, спакујте је и замотајте.

5. 121 степен Целзијуса, 30 мин

6. 180 степени Целзијуса, суши се неколико сати (најмање 3 сата)

Напомена: а.Носите латекс рукавице и маске када рукујете ДЕПЦ-ом!б, или без ДЕПЦ стерилизације, 130 ℃, 90 мин аутоклава (многе лабораторије стерилизација на високој температури два пута)

Разматрања екстракције РНК

Два главна феномена неуспеха изолације ткивне РНК

деградација РНК и остаци нечистоћа у ткивима,што се тиче деградације, хајде да прво погледамо зашто се РНК екстрахована из култивисаних ћелија не разграђује лако.Сви постојећи реагенси за екстракцију РНК садрже компоненте које брзо инхибирају РНКазу.Додајте лизат у култивисане ћелије и једноставно га помешајте, све ћелије се могу темељно измешати са лизатом, а ћелије су потпуно лизиране.Након што се ћелије лизирају, активни састојци у лизату одмах инхибирају интрацелуларну РНКазу, тако да РНК остаје нетакнута.Наиме, пошто се култивисане ћелије лако и потпуно доводе у контакт са лизатом, њихова РНК се не разграђује лако;с друге стране, РНК у ткиву се лако разграђује јер ћелијама у ткиву није лако брзо контактирати лизат.због довољног контакта.Тако,под претпоставком да постоји начин да се ткиво претвори у једну ћелију док се инхибира активност РНК, проблем деградације би могао бити потпуно решен.

Млевење течним азотом је најефикаснији такав метод.Међутим, метода млевења течним азотом је веома проблематична, посебно када је број узорака велики.Ово је довело до следеће најбоље ствари: хомогенизатора.ТхехомогенизаторМетода не разматра питање како се активност РНазе инхибира пре него што ћелије ступе у контакт са лизатом, већ се радије моли да је брзина поремећаја ткива бржа од брзине којом интрацелуларна РНАза разграђује РН.

Ефекат електричног хомогенизатора је бољи,а ефекат хомогенизатора стакла је лош, али генерално, метода хомогенизатора не може спречити феномен деградације.Стога, ако је екстракција деградирана, оригинални електрични хомогенизатор треба користити за млевење са течним азотом;оригинални стаклени хомогенизатор треба променити у електрични хомогенизатор или директно млевени течним азотом.Проблем је скоро 100% изводљив.решити се.

Проблем остатака нечистоћа који утиче на наредне експерименте има више различитих узрока од деградације, а решења су сходно томе различита.У закључку,ако постоји деградација или заостале нечистоће у ткиву, метод екстракције/реагенс за одређени експериментални материјал мора бити оптимизован.Не морате да користите своје драгоцене узорке за оптимизацију: можете купити неке мале животиње попут рибе/пилића са пијаце, узети одговарајући део материјала за екстракцију РНК, а други део за екстракцију протеина – самлети са устима, желуцем и екстрактом црева.

Циљна РНК екстраховане РНК се користи за различите накнадне експерименте, а њени захтеви за квалитет су различити

Конструкција библиотеке цДНК захтева интегритет РНК без остатака инхибитора ензимске реакције;Нортхерн захтева већи интегритет РНК и ниже захтеве за остатке инхибитора ензимске реакције;РТ-ПЦР не захтева превисок интегритет РНК,али инхибира реакције ензима.Захтеви за остатке су строги.Улаз одређује излаз;сваки пут када је циљ да се добије РНК највише чистоће, то ће коштати људе и новац.

Сакупљање/чување узорака

Фактори који утичу на деградацију Након што узорак напусти живо тело/или првобитно окружење раста, ендогени ензими у узорку ће почети да разграђују РНК,а брзина разградње је повезана са садржајем ендогених ензима и температуром.Традиционално, постоје само два начина да се потпуно инхибира активност ендогеног ензима: одмах додати лизат и темељно и брзо хомогенизовати;исећи на мале комаде и одмах замрзнути у течном азоту.Оба приступа захтевају брз рад.Овај други је погодан за све узорке, док је први погодан само за ткива са малим садржајем ћелија и ендогених ензима и лакша за хомогенизацију.Конкретно, биљно ткиво, јетра, тимус, панкреас, слезина, мозак, масноће, мишићно ткиво, итд. је најбоље замрзнути течним азотом пре него што наставите.

Фрагментација и хомогенизација узорака

Фактори који утичу на деградацију и принос Фрагментација узорка језа темељну хомогенизацију, што је за потпуно и потпуно ослобађање РНК.Ћелије се могу директно хомогенизовати без ломљења.Ткива се могу хомогенизовати тек након ломљења.Квасац и бактерије треба да се разбију одговарајућим ензимима пре него што се могу хомогенизовати.Ткива са нижим садржајем ендогених ензима и лакшом хомогенизацијом могу се уситнити и хомогенизовати у једном тренутку у лизату помоћу хомогенизатора;биљно ткиво, јетра, тимус, панкреас, слезина, мозак, масноћа, мишићно ткиво и други узорци, или су богати ендогеним ензимима или нису лако хомогенизовани,па се поремећај ткива и хомогенизација морају вршити одвојено.Најпоузданији и најпродуктивнији метод фрагментације је млевење течним азотом, а најпоузданији метод хомогенизације је употреба електричног хомогенизатора.Посебна напомена о млевењу са течним азотом: узорак не сме да се одмрзава током целог процеса млевења, јер постоји већа вероватноћа да ће ендогени ензими функционисати када су замрзнути.

Избор лизата

Утицај на погодност рада и факторе резидуалних ендогених нечистоћа. Уобичајени раствори за лизу могу скоро да инхибирају активност РНазе.Стога, кључна тачка избора раствора за лизу је разматрање у комбинацији са методом пречишћавања.Постоји један изузетак:узорцима са високим садржајем ендогених ензима препоручује се употреба лизата који садржи фенол да би се повећала способност инактивације ендогених ензима.

Избор методе пречишћавања

Фактори који утичу на резидуалне ендогене нечистоће, брзину екстракције За чисте узорке као што су ћелије, задовољавајући резултати се могу добити готово било којом методом пречишћавања.Али за многе друге узорке, посебно оне са високим нивоом нечистоћа као што су биљке, јетра, бактерије, итд., одабир одговарајуће методе пречишћавања је кључан.Метода центрифугалног пречишћавања колоне има велику брзину екстракције и може ефикасно уклонити нечистоће које утичу на накнадну ензимску реакцију РНК, али је скупа (Форегене може понудити исплативе комплете, више детаља кликнитеовде);коришћењем економичних и класичних метода пречишћавања, као што је преципитација ЛиЦл, такође се могу добити задовољавајући резултати, али је време рада дуго..

„Три дисциплине и осам пажње“ за екстракцију РНК

Дисциплина 1:Ставите тачку на контаминацију егзогених ензима.

Напомена 1:Строго носите маске и рукавице.

Ноте 2:Епрувете за центрифугирање, врхове, шипке за пипете, резервоаре за електрофорезу и експерименталне клупе укључене у експеримент треба темељно одложити.

Напомена 3:Реагенси/раствори укључени у експеримент, посебно вода, морају бити без РНКазе.

Дисциплина 2:Блокирајте активност ендогених ензима

Напомена 4:Изаберите одговарајући метод хомогенизације.

Напомена 5:Изаберите одговарајући лизат.

Напомена 6:Контролишите почетну количину узорка.

Дисциплина 3:Појасните своју сврху екстракције

Напомена 7:Са било којим системом лизата који се приближава максималној почетној количини узорка, стопа успеха екстракције нагло опада.

Напомена 8:Једини економски критеријум за успешну екстракцију РНК је успех у наредним експериментима, а не принос.

Топ 10 извора контаминације РНасе

1. Прсти су први извор егзогених ензима, тако да се рукавице морају често носити и мењати.Осим тога, морају се носити и маске, јер је дисање такође важан извор ензима.Додатна предност ношења маске за рукавице је заштита експериментатора.

2. Врхови за пипете, епрувете за центрифугирање, пипете – РНаза се не може инактивирати само стерилизацијом, тако да врхове пипета и епрувете за центрифугирање треба третирати ДЕПЦ, чак и ако су означени као ДЕПЦ третирани.Најбоље је користити пипету посебне намене, пре употребе је обрисати ватом са 75% алкохола, посебно штапићем;поред тога, уверите се да не користите средство за уклањање главе.

3. Вода/пуфер мора бити без контаминације РНасе.

4. Барем тестни сто треба обрисати ватом са 75% алкохола.

5.Ендогена РНКаза Сва ткива садрже ендогене ензиме, тако да је брзо замрзавање ткива течним азотом најбољи начин да се смањи деградација.Метода складиштења/мљевења течног азота је заиста незгодна, али је то једини начин за ткива са високим нивоом ендогених ензима.

6. Узорци РНК Производи екстракције РНК могу садржати трагове контаминације РНКазом.

7. Екстракција плазмида Екстракција плазмида често користи Рназу за разградњу РНК, а преостала Рназа треба да се дигестира са Протеиназом К и екстрахује помоћу ПЦИ.

8. Чување РНК Чак и ако се чува на ниској температури, количине РНК у траговима ће изазвати деградацију РНК.Најбоље решење за дуготрајно очување РНК је суспензија соли/алкохола, јер алкохол на ниским температурама инхибира сву ензимску активност.

9. Када катјони (Ца, Мг) садрже ове јоне, загревање на 80Ц у трајању од 5 минута ће изазвати цепање РНК, тако да ако РНК треба да се загреје, раствор за конзервацију треба да садржи хелататор (1мМ натријум цитрат, пХ 6,4).

10. Ензими коришћени у наредним експериментима могу бити контаминирани РНазом.

10 савета за екстракцију РНК

1: Брзо спречите активност РНазе.Узорци се брзо замрзавају након сакупљања, а РНасе се инактивира брзим радом током лизе.

2: Изаберите одговарајући метод екстракције за ткиво са високим садржајем рибозима, а масно ткиво је најбоље користити методу која садржи фенол.

3: Квалитет предвиђања захтева Нортхерн, конструкција библиотеке цДНК захтева висок интегритет, а РТ-ПЦР и РПА (тест заштите рибонуклеазе) не захтевају висок интегритет.РТ-ПЦР захтева високу чистоћу (остаци инхибитора ензима).

4: Темељна хомогенизација је кључ за побољшање приноса и смањење деградације.

5: Проверите интегритет детекције РНК електрофорезе, 28С: 18С = 2:1 је потпуни знак, 1:1 је такође прихватљив за већину експеримената.

6: Уклањање ДНК за РТ-ПЦР, анализа низа Најбоље је користити Дназу И за уклањање ДНК.

7: Смањите контаминацију егзогених ензима – ензими се не могу увести споља.

8: Када се концентрише нуклеинска киселина ниске концентрације, треба додати реагенс за копреципитацију.Али да се спречи контаминација копреципитанта који садржи ензиме и ДНК.

9: Темељно растворите РНК, ако је потребно, загрејте на 65Ц 5 минута.

одговарајући начин складиштења

Кратко се може чувати на –20Ц, а дуго на –80Ц.Први корак у побољшању приноса РНК је схватање да садржај РНК у различитим узорцима веома варира.Висока количина (2-4 уг/мг) као што су јетра, панкреас, срце, средња (0,05-2 уг/мг) као што су мозак, ембрион, бубрези, плућа, тимус, јајник, ниска (<0,05 уг/мг) мг) као што су бешика, кости, масноћа.

1: Лизу ћелија за ослобађање РН – ако се РНК не ослободи, принос ће бити смањен.Електрична хомогенизација ради боље од других метода хомогенизације, али ће можда морати да се комбинује и са другим методама, као што је гњечење течним азотом, ензимско варење (лизозим/литиказа)

2: Оптимизација методе екстракције.Највећи проблеми са методама заснованим на фенолу су непотпуна стратификација и делимични губитак РНК (супернатант се не може потпуно уклонити).Непотпуна стратификација је због високог садржаја нуклеинске киселине и протеина, што се може решити повећањем количине коришћеног лизата или смањењем количине узорка.Корак екстракције хлороформом је додат у масно ткиво.Губитак РНК се може смањити повратним пумпањем или уклањањем органског слоја након чега следи центрифугирање.Највећи проблем са методама заснованим на центрифугирању колоне је вишак узорка.

Класични савети за екстракцију

1. Пречишћавање фенола: Додајте једнаку запремину 1:1 фенол/хлороформ и снажно мешајте 1-2 минута.Центрифугирајте великом брзином 2 минута.Пажљиво уклоните супернатант (80-90%).Никада немојте доћи до средњег слоја.Једнака запремина реакционог раствора се може додати у фенол/хлороформ и супернатант се уклони.Два супернатанта се могу мешати заједно за преципитацију нуклеинске киселине да би се побољшао принос.Немојте бити превише нежни приликом мешања и не покушавајте да уклоните сав супернатант.

2. Прање са 70-80% етанола: Током прања, нуклеинска киселина мора бити суспендована да би се осигурало да се заостала со испере.Истовремено, одмах након изливања етанола, центрифугирати великом брзином неколико секунди, а затим пипетом уклонити преостали етанол.Растворити након стајања на собној температури 5-10 минута.

11. Екстракција посебних организација

1. Влакнасто ткиво: Кључ за екстракцију РНК из фиброзног ткива као што је срце/скелетни мишић је потпуно пореметити ткиво.Ова ткива имају малу ћелијску густину, тако да је количина РНК по јединици тежине ткива ниска и најбоље је користити што је могуће већу почетну количину.Обавезно добро измрвите ткиво под условима смрзавања.

2. Ткива са високим садржајем протеина/масти: садржај мозга/биљне масти је висок.Након екстракције ПЦИ, супернатант садржи беле флокуле.Супернатант се мора поново екстраховати хлороформом.

3. Ткива са високим садржајем нуклеинске киселине/рибозима: слезина/тимус има висок садржај нуклеинске киселине и рибозима.Мљевење ткива под условима замрзавања праћено брзом хомогенизацијом може ефикасно инактивирати рибозиме.Међутим, ако је лизат превише вискозан (због високог садржаја нуклеинске киселине), екстракција ПЦИ неће моћи ефикасно да се стратификује;додавање више лизата може решити овај проблем.Вишеструке екстракције ПЦИ могу уклонити више резидуалне ДНК.Ако се бели талог формира одмах након додавања алкохола, то указује на контаминацију ДНК.Поновна екстракција киселим ПЦИ након растварања може уклонити контаминацију ДНК.

4. Биљно ткиво: Биљно ткиво је сложеније од животињског.Генерално, биљке се мељу у условима течног азота, тако да је деградација РНК ендогеним ензимима неуобичајена.Ако проблем деградације није решен, готово је сигурно узрокован нечистоћама садржаним у узорку.Нечистоће садржане у многим биљкама довешће до остатака, а разлог за остатке је често зато што ове нечистоће имају неке сличности са РНК: ви преципитирате, а ја таложим, а ви адсорбујете, а ја адсорбујем.Ове карактеристике одређују да су они веома јаки инхибитори ензима.

Тренутно, комерцијални реагенси за екстракцију РНК могу се прилагодити скоро свим животињским ткивима уз мала прилагођавања, али постоји неколико комерцијалних реагенса за екстракцију РНК који могу бити погодни за већину биљних ткива.На срећу, Форегене може да обезбеди специјалнекомплети за екстракцију РНК биљака, имамоКомплет за изолацију укупне РНК биљака, Комплет за изолацију укупне РНК биљака Плус.Потоњи је посебно дизајниран за биљке са високим садржајем полисахарида и полифенола.За екстракцију РНК, повратне информације од корисника лабораторије су посебно добре.

12. Ефекат замрзавања и одмрзавања узорака Замрзнути узорак може бити већи и потребно га је исећи пре него што се употреби за екстракцију РНК.Узорци имају тенденцију да се топе (могуће делимично) током сечења.Замрзнути узорци ће можда морати да се извагају пре екстракције РНК, а током овог процеса ће се дефинитивно десити одмрзавање.Понекад се одмрзавање узорка дешава и током процеса млевења течног азота;или се замрзнути узорак директно додаје у лизат без млевења течним азотом, а одмрзавање ће се дефинитивно десити пре потпуне хомогенизације.Експерименти су показали да је замрзнуто ткиво склоније деградацији РНК током одмрзавања него свеже ткиво.Вероватан разлог: процес замрзавања-одмрзавања ремети структуре унутар ћелије, што олакшава ендогеним ензимима да дођу у директан контакт са РНК.

13. Процена квалитета РНК Обично се електрофореза користи да би се проценио интегритет РНК, а А260/А280 се користи за процену чистоће РНК.У теорији, интактна РНК има однос 28С:18С = 2,7:1, а већина података наглашава однос 28С:18С = 2:1.Чињеница је да скоро ниједна РНК екстрахована из узорака осим ћелија није у односу 2:1 (ово је добијено коришћењем Агилент Биоанализер-а).

На резултате електрофорезе РНК утичу многи фактори, укључујући секундарну структуру, услове електрофорезе, оптерећење узорка, степен засићености ЕБ, итд. Користите нативну електрофорезу за детекцију РНК и користите ДНК маркер као контролу.Ако су 28С на 2 кб и 18С на 0,9 кб чисти, а 28С: 18С > 1, интегритет може испунити захтеве већине наредних експеримената.

А260/А280 је индикатор који је изазвао доста забуне.Пре свега, потребно је разјаснити првобитно значење овог индикатора за нуклеинске киселине: чиста РНК, њен А260/280 = око 2,0.Чиста РНК је 'узрок', а А260/А280 = 2 је 'последица'.Сада сви користе А260/А280 као „узрок“, мислећи да „ако је А260/А280 = 2, онда је РНК чиста“, што природно доводи до забуне.

Ако сте заинтересовани, можете додати мало реагенса који се често користи у екстракцији, као што су фенол, гванидин изотиоцијанат, ПЕГ, итд., у ваш РНК узорак, а затим измерите однос А260/А280.Реалност је да многи реагенси који се користе за екстракцију РНК, као и многе нечистоће у узорку, апсорбују око А260 и А280, утичући на А260/А280.

Најпоучнији приступ тренутно је скенирање узорака РНК у опсегу од 200-300 нм.Крива чисте РНК има следеће карактеристике: крива је глатка, А230 и А260 су две превојне тачке, А300 је близу 0, А260/А280 = око 2,0 и А260/А230 = око 2,0.Ако подаци скенирања нису доступни, мора се одредити и однос А260/А230, пошто је овај однос осетљивији на преношење свих нечистоћа које утичу на ензимску реакцију.Узмите у обзир линеарни опсег уређаја (0,1–0,5 за А260).

Постоје још два корисна феномена: однос ће бити око 0,3 мањи када се А260/А280 мери у води;док је однос измерен у 10 мМ ЕДТА за око 0,2 већи од оног измереног у 1 мМ ЕДТА.

Сродни производи:

Произвођач и добављач комплета за изолацију комплетне РНА у Кини |Форегене (фореивд.цом)

Серија изолације РНК Добављачи и фабрике |Кинески произвођачи серије РНА изолације (фореивд.цом)

Серија изолације РНК – Форегене Цо., Лтд. (фореивд.цом)