1. Почетно разумевање

У овој фази, морамо да разумемо неке концепте и терминологију, како не бисмо правили грешке пред нашим сениорима, као што су:

П: Која је разлика између РТ-ПЦР, кПЦР, ПЦР у реалном времену и РТ-ПЦР у реалном времену?

Одговор: РТ-ПЦР је ПЦР са реверзном транскрипцијом(реверзна транскрипција ПЦР, РТ-ПЦР), која је широко коришћена варијанта ланчане реакције полимеразе (ПЦР).У РТ-ПЦР-у, РНК ланац се реверзно транскрибује у комплементарну ДНК, која се затим користи као шаблон за амплификацију ДНК помоћу ПЦР-а.
ПЦР у реалном времену и кПЦР(Куантитативе Реа-лтиме-ПЦР) су иста ствар, оба су квантитативни ПЦР у реалном времену, што значи да сваки циклус ПЦР-а има записе података у реалном времену, тако да се број почетних шаблона може подесити прецизном анализом.

Иако се чини да су и ПЦР у реалном времену (флуоресцентни квантитативни ПЦР у реалном времену) и ПЦР са реверзном транскрипцијом (реверзна транскрипција ПЦР) скраћено РТ-ПЦР, међународна конвенција гласи: РТ-ПЦР се посебно односи на реверзну транскрипцијуПЦР , ПЦР у реалном времену се обично скраћено назива кПЦР (квантитативни ПЦР у реалном времену).

И РТ-ПЦР у реалном времену (РТ-кПЦР), то је ПЦР реверзне транскрипције у комбинацији са флуоресцентном квантитативном технологијом: прво набавите цДНК (РТ) из РНК реверзне транскрипције, а затим користите ПЦР у реалном времену за квантитативну анализу (кПЦР).Већина лабораторија ради РТ-кПЦР, односно истражује смањење експресије РНК, тако да се кПЦР о којем сви говоре у лабораторији заправо односи на РТ-кПЦР, али не заборавите да још увек постоји много ДНК тестова у клиничким применама.Квантитативна анализа, као што је откривање ХБВ вируса хепатитиса Б.

Питање: Након читања много флуоресцентног квантитативног ПЦР-а, зашто би амплификовани фрагмент требало контролисати у опсегу од 80-300бп?

Одговор: Дужина сваке секвенце гена је другачија, неке су неколико кб, неке стотине бп, али морамо само да захтевамо да дужина производа буде 80-300бп када дизајнирамо прајмере, прекратки или предугачки нису погодни за флуоресцентну квантитативну ПЦР детекцију.Фрагмент производа је прекратак да би се могао разликовати од прајмера-димера.Дужина прајмера-димера је око 30-40бп и тешко је разликовати да ли је прајмер-димер или производ ако је мањи од 80бп.Ако је фрагмент производа предугачак и прелази 300 бп, то ће лако довести до ниске ефикасности амплификације и не може ефикасно открити количину гена.

На пример, када рачунате колико је људи у учионици, потребно је само да избројите колико има уста.Исто важи и када детектујете гене, потребно је само да откријете одређену секвенцу гена да бисте представили цео низ.Ако желите да пребројите људе, морате пребројати и уста и нос, уши и наочаре, а лако је погрешити.

Да проширимо, у биолошким истраживањима постоји много истраживачких случајева од тачке до области, јер је секвенца гена било које врсте веома дуга, непотребно је и немогуће мерити све фрагменте, као што је бактеријско 16С секвенцирање, што је да се изврши конзервативна секвенца бактеријских тестова да се закључи број одређене популације бактерија.

П: Која је оптимална дужина за кПЦР дизајн прајмера?

Одговор: Уопштено говорећи, дужина прајмера је око 20-24бп, што је боље.Наравно, приликом пројектовања прајмера морамо обратити пажњу на ТМ вредност прајмера, јер се то односи на оптималну температуру жарења.После много експеримената, доказано је да је 60°Ц боља ТМ вредност.Ако је температура жарења прениска, то ће лако довести до неспецифичног појачања.Ако је температура жарења превисока, ефикасност амплификације ће бити релативно ниска, врх криве појачања ће почети касније, а ЦТ вредност ће бити одложена.

П: Како се метода бојења разликује од методе сонде?

Одговор: Метода бојењаНеке флуоресцентне боје, као што су СИБР Греен Ⅰ, ПицоГреен, БЕБО, итд., не емитују светлост саме, али ће емитовати флуоресценцију након везивања за мањи жлеб дволанчане ДНК.Због тога, на почетку ПЦР реакције, машина не може да детектује флуоресцентни сигнал.Када реакција достигне фазу жарења-екстензије, двоструки ланац се отвара и нови ланац се синтетише под дејством ДНК полимеразе, а флуоресцентни молекул се везује за мањи жлеб дсДНК.Како се број ПЦР циклуса повећава, све више и више боја се комбинује са дволанчаном ДНК, а флуоресцентни сигнал се такође континуирано појачава.Метода бојења се углавном користи у научним истраживањима.
ПС: Будите опрезни када радите експеримент, боја мора бити комбинована са људском ДНК, пазите да је претворите у флуоресцентну особу.

Метода бојења (лево) Метода сонде (десно)
ПС: Будите опрезни када радите експеримент, боја мора бити комбинована са људском ДНК, пазите да је претворите у флуоресцентну особу.

СИБР Греен Ⅰ се везује за мањи жлеб ДНК

Метода сондеТакман сонда је најчешће коришћена сонда за хидролизу.Постоји флуоресцентна група на 5′ крају сонде, обично ФАМ, а сама сонда је секвенца комплементарна циљном гену.На крају 3′ налази се група за гашење флуоресцентног гаса.Према принципу преноса енергије флуоресцентне резонанце (Форстер резонантни пренос енергије, ФРЕТ), када су репортерска флуоресцентна група (донорски флуоресцентни молекул) и гасећа флуоресцентна група (акцепторски флуоресцентни молекул) побуђене Када се спектри преклапају и удаљеност је веома блиска, флуоресцентни флуоресцентни молекул (7-10) може да се ексцитира. це молекула акцептора, док је аутофлуоресценција ослабљена.Стога, на почетку ПЦР реакције, када је сонда слободна и нетакнута у систему, репортерска флуоресцентна група неће емитовати флуоресценцију.Приликом жарења, прајмер и сонда се везују за шаблон.Током фазе екстензије, полимераза континуирано синтетише нове ланце.ДНК полимераза има 5′-3′ егзонуклеазну активност.Када стигне до сонде, ДНК полимераза ће хидролизовати сонду из шаблона, одвојити репортерску флуоресцентну групу од флуоресцентне групе гаситеља и ослободити флуоресцентни сигнал.Пошто постоји однос један-на-један између сонде и шаблона, метода сонде је супериорнија од методе бојења у смислу тачности и осетљивости теста.Метода сонде се углавном користи у дијагнози.

П: Шта је апсолутна квантификација?Шта је релативна квантификација?

Одговор: Апсолутна квантификација се односи на израчунавање почетног броја копија узорка који се тестира кПЦР-ом, као што је колико ХБВ вируса има у 1 мл крви.Резултат добијен релативном квантификацијом је промена количине циљног гена у специфичном узорку у односу на други референтни узорак, а експресија гена је регулисана навише или наниже.

П: Да ли ће количина екстракције РНК, ефикасност реверзне транскрипције и ефикасност амплификације утицати на експерименталне резултате?
П: Да ли ће складиштење узорака, реагенси за екстракцију, реагенси за реверзну транскрипцију и потрошни материјали који преносе светлост утицати на експерименталне резултате?
П: Који метод може да исправи експерименталне податке?

Што се тиче ових питања, детаљно ћемо их описати у напредним и напредним одељцима у наставку.
2. Напредна знања

Што се тиче флуоресцентне квантитативне ПЦР у реалном времену, морамо признати реалност да се сваке године објављује на хиљаде научно-истраживачких радова, међу којима није мали број флуоресцентна квантитативна ПЦР технологија.

Ако не постоји заједнички стандард за мерење флуоресцентног квантитативног ПЦР експеримента, резултати могу веома варирати.За исти ген исте врсте, са истим методом обраде, резултати детекције ће такође увелико варирати, а каснијима ће бити тешко да понове исте резултате.Ви Нико не зна шта је исправно, а шта погрешно.

Да ли то значи да је флуоресцентни квантитативни ПЦР технологија варања или непоуздана технологија?Не, то је зато што је флуоресцентни квантитативни ПЦР осетљивији и прецизнији, а мало погрешна операција ће дати потпуно супротне резултате.Мали губитак удаљен је хиљаду миља.Рецензенти могу више пута мучити аутора чланка.Истовремено, рецензенте часописа је такође тешко изабрати међу различитим експерименталним резултатима.

Све у свему, указује на недостатак консензуса у ПЦР експериментима у реалном времену.У ту сврху, виши научници у индустрији почели су да формулишу стандарде,захтевајући од сарадника да наведу неке неопходне експерименталне детаље и детаље обраде података (укључујући неопходне податке) у чланку како би испунили ове стандарде.

Рецензенти могу проценити квалитет експеримента читајући ове детаље;будући читаоци такође могу да користе ово да понове експеримент или побољшају експеримент.Тада су експериментални резултати добијени на овај начин пуни информација, квалитетни и употребљиви.

МИББИ (минималне информације за биолошка и биомедицинска истраживања -хттп://ввв.мибби.орг) настао.МИББИ је пројекат који обезбеђује стандарде за експерименте.Објављује се у природи.Овај пројекат је усмерен на различите биолошке експерименте, укључујући ћелијску биологију, Мицроарраи, кПЦР о којима ћемо сада разговарати, итд., И предвиђа сваку врсту експеримента приликом подношења рукописа.Те информације треба да буду дате у сваком тренутку.

У МИББИ пројекту постоје два чланка везана за флуоресцентни квантитативни ПЦР и то:
·РДМЛ (Реал-Тиме ПЦР Дата Маркуп Лангуаге) – структурирани језик и водич за извештавање за квантитативне ПЦР податке у реалном времену;
·МИКЕ (Минималне информације за објављивање квантитативних ПЦР експеримената у реалном времену) – минималне информације за објављивање чланака о квантитативним ПЦР експериментима у реалном времену.
Прво, хајде да причамо о РДМЛ-у, спецификацији терминологије.

Ако не постоји стандардна дефиниција за све, немогуће је наставити дискусију, због чега је објашњење појмова толико важно на испиту.
Терминологија коришћена у флуоресцентном квантитативном ПЦР експерименту укључује следећи садржај.Киаген је направио најбољи резиме за нас.Све су сувиробе .

Крива појачања
Крива амплификације се односи на криву направљену током ПЦР процеса, са бројем циклуса на апсциси и интензитетом флуоресценције у реалном времену током реакције као ординатом.

Одлична крива појачања треба да има следеће карактеристике: основна линија је равна или благо смањена и нема очигледног узлазног тренда;тачка прегиба криве је јасна, а нагиб експоненцијалне фазе је пропорционалан ефикасности појачања.Што је већи нагиб, то је већа ефикасност појачања;укупна крива појачања Паралелизам је добар, што указује да је ефикасност појачања сваке цеви слична;експоненцијална фаза криве амплификације узорака ниске концентрације је очигледна.

Основни (основни)
Основна линија је ниво буке раног циклуса, обично се мери између 3. и 15. циклуса, јер се повећање вредности флуоресценције изазвано производом амплификације не може детектовати током овог периода.Број циклуса који се користи за израчунавање основне линије може да варира и може бити потребно да се смањи ако се користе велике количине шаблона или ако је ниво експресије циљног гена висок.

Подешавање основне линије захтева преглед података о флуоресценцији са криве линеарности амплификације.Основна линија је постављена тако да раст криве појачања почиње са бројем циклуса већим од највећег броја основног циклуса.Полазне линије морају бити постављене појединачно за сваку циљну секвенцу.Просечне вредности флуоресценције откривене у раним циклусима треба да се одузму од вредности флуоресценције добијених у појачаним производима.Најновије верзије различитог софтвера за ПЦР у реалном времену омогућавају аутоматску оптимизацију основних поставки за појединачне узорке.

Током првих неколико циклуса реакције ПЦР амплификације, сигнал флуоресценције се не мења много.Приближавање правој линији назива се основна линија, али ако пажљиво погледамо првих неколико циклуса, видимо да се унутар основне линије дешава оно што се дешава на слици испод.

Позадина позадине односи се на
вредност неспецифичне флуоресценције у реакцији.На пример: неефикасна гашење флуоресценције;или велики број дволанчаних ДНК шаблона због употребе СИБР Греен.Позадинске компоненте сигнала се математички уклањају софтверским алгоритмом за ПЦР у реалном времену.

Сигнал репортера
Репортерски сигнал се односи на флуоресцентни сигнал који генерише СИБР Греен или флуоресцентно обележене сонде специфичне за секвенцу током ПЦР-а у реалном времену.

Нормализовани репортерски сигнал (РН)
РН се односи на интензитет флуоресценције репортерске боје подељен са интензитетом флуоресценције пасивне референтне боје измерен у сваком циклусу.

Пасивна референтна боја
У неким ПЦР-овима у реалном времену,флуоресцентна боја РОКС се користи као интерна референца за нормализацију флуоресцентног сигнала.Исправља варијације због нетачног пипетирања, положаја бунара и флуктуација флуоресценције на бази бушотине.

Праг флуоресцентности (праг)
је подешен изнад позадинске вредности и значајно испод вредности платоа криве амплификације.Мора да лежи у линеарном региону криве амплификације, представљајући лог-линеарни опсег ПЦР детекције.Прагове треба поставити у приказу криве логаритамске амплификације тако да се лог-линеарна фаза ПЦР-а лако може идентификовати.Ако постоји више циљних гена у ПЦР-у у реалном времену, праг мора бити постављен за сваку мету.Генерално, сигнал флуоресценције првих 15 циклуса ПЦР реакције се користи као позадински сигнал флуоресценције, а праг флуоресценције је 10 пута већи од стандардне девијације сигнала флуоресценције првих 3 до 15 циклуса ПЦР-а, а праг флуоресценције је постављен у ПЦР експонентној фази.Генерално, сваки инструмент има свој праг флуоресценције подешен пре употребе.

Праг циклуса (ЦТ) или прелазна тачка (ЦП)
Циклус у којем крива амплификације прелази праг (тј. тачка у којој се детекција флуоресценције значајно повећава).ЦТ може бити разломак и количина почетног шаблона се може израчунати.ЦТ вредност представља број циклуса када флуоресцентни сигнал у свакој ПЦР реакционој епрувети достигне постављени праг.Постоји линеарна веза између ЦТ вредности сваког шаблона и логаритма почетног броја копије шаблона, тј.већи је почетни број копије, мања је ЦТ вредност, и обрнуто.Стандардна крива се може направити коришћењем стандарда са познатим почетним бројем копије, при чему апсциса представља ЦТ вредност, а ордината представља логаритам почетног броја копије.Стога, све док се добије ЦТ вредност непознатог узорка, почетни број копије узорка може се израчунати из стандардне криве.

ΔЦТ вредност
ΔЦТ вредност описујеразлика између циљног гена и ЦТ вредности одговарајућег ендогеног референтног гена, као што је ген за одржавање домаћинства, и користи се за нормализацију количине коришћеног шаблона:
⇒ΔЦТ = ЦТ (циљни ген) – ЦТ (ендогени референтни ген)

ΔΔЦТ вредност
ΔΔЦТ вредност описује разлику између средње вредности ΔΔЦТ узорка од интереса (нпр. стимулисане ћелије) и средње вредности ΔΔЦТ референтног узорка (нпр. нестимулисане ћелије).Референтни узорак се такође назива калибрациони узорак и сви остали узорци су нормализовани на ово за релативну квантификацију:
⇒ΔΔЦТ = просечна ΔЦТ (узорак од интереса) – просечна ΔЦТ (референтни узорак)

Ендогени референтни гени (ендогени референтни гени)
Нивои експресије ендогених референтних гена, као што су кућни гени (гени за одржавање), не разликују се између узорака.Поређење ЦТ вредности референтног гена са циљним геном омогућава да се ниво експресије циљног гена нормализује на количину улазне РНК или цДНК (погледајте одељак о ΔЦТ вредностима изнад).

Интерни референтни гени тачни замогућа деградација РНК или присуство инхибитора ензима у узорцима РНК, као и варијације у садржају РНК, ефикасност реверзне транскрипције, опоравак нуклеинске киселине и руковање узорком.Да бисмо изабрали оптимални референтни ген(е), модификовали смо алгоритам како бисмо омогућили његов избор оптималне референце у зависности од експерименталног подешавања.

Интерна контрола
Контролна секвенца која је амплификована у истој реакцији као циљна секвенца и испитана другом сондом (тј. извођењем дуплекс ПЦР).Интерне контроле се често користе да би се искључила неуспела појачања, на пример када циљна секвенца није откривена.
Узорак калибрације
Референтни узорак (на пример, пречишћена РНК из ћелијске линије или ткива) који се користи у релативној квантификацији за поређење свих других узорака да би се одредио релативни ниво експресије гена.Узорак за калибрацију може бити било који узорак, али је обично контролни (на пример, необрађен узорак или узорак из нултог времена експеримента).

Позитивне контроле
користите контролне реакције саПознати износи шаблона.Позитивне контроле се често користе да би се проверило да ли сет прајмера или сет прајмера-сонде ради исправно и да ли је реакција правилно подешена.

Без контроле шаблона (НТЦ)
Контролна реакција која садржи све неопходне компоненте реакције амплификације осим шаблона, који се обично замењује водом.Коришћењем НТЦ може се пронаћи контаминација узрокована контаминацијом реагенсом или страном ДНК, чиме се обезбеђује аутентичност и поузданост података детекције.Појачавање НТЦ контроле указује на контаминацију.

НО РТ ЦОНТРОЛ (НРТ)
НТР контрола је магично огледало за откривање загађења ДНК.Ако постоји појачање, то значи да постоји загађење.

Стандарди
Стандарди су узорци познате концентрације или броја копија који се користе за конструисање стандардне криве.Да би се обезбедила стабилност стандарда, фрагмент гена се обично клонира у плазмид и користи као стандард.

Стандардна крива
За сваку стандардну криву треба проверити њену валидност.Вредност нагиба је између –3,3 и –3,8, а свака концентрација се изводи у три примерка.Тачке које се значајно разликују од других тачака треба одбацити.

Ефикасност и нагиб
Нагиб стандардне криве представља ефикасност ПЦР-а у реалном времену.

· Нагиб мањи од –3,322 (нпр. –3,8) указује на ефикасност ПЦР-а
Ова ситуација се јавља у нелинеарној фази ПЦР реакције, односно постоји велика количина неспецифичне амплификације.

кривуља топљења
Након што је кПЦР амплификација завршена, ПЦР производ се загрева.Како температура расте, дволанчани производ амплификације се постепено топи, што доводи до смањења интензитета флуоресценције.Када се достигне одређена температура (Тм), велики број производа ће се истопити.Флуоресценција нагло опада.Различити ПЦР производи имају различите Тм вредности и различите температуре топљења, тако да се може идентификовати специфичност ПЦР-а.

Кривуља топљења (деривата крива)
Крива топљења је изведена да формира мапу пикова, која може интуитивније приказати ситуацију фрагмената ПЦР производа.дужина појачаног производа је у опсегу од 80-300бп, тако да температура топљења треба да буде између 80°Ц и 90°Ц.

Тумачење криве топљења: Ако се једини главни пик појави између 80°Ц-90°Ц, то значи да је флуоресцентни квантитативни ПЦР савршен;ако се главни пик појављује између 80°Ц-90°Ц, а разни пикови се појављују испод 80°Ц, у основи се узима у обзир димер прајмера.Можете покушати да повећате температуру жарења да бисте то решили;

Наравно, још увек постоје неке абнормалне ситуације, које ће бити разложене једну по једну у наставку.
3. Напредно знање

Да бих урадио кПЦР, морам да кажем МИКЕ,Минималне информацијеза објављивањеКвантитативанПЦР у реалном временуЕксперименти — минималне информације за објављивање чланака о квантитативном ПЦР-у у реалном временуЕксперименти.Да бисмо свима поједноставили разумевање, поједноставићемо кључни садржај.

Оригинални текст МИКЕ-а можете претраживати на Интернету, а најважније је да он предвиђаконтролна листа података коју је потребно обезбедити приликом објављивања чланка .

Рецензенти могу проценити квалитет експеримента читајући ове детаље;будући читаоци такође могу да искористе ово да понове или побољшају експеримент.
Вреди напоменути да је на овој листи важност сваке листе означена са Е или Д.Шта то значи?Е: битне информације (морају се доставити);Д: пожељне информације (наведите што је више могуће).

МИКЕ (1)— Експериментални дизајн
Овако се праве олоши!

Ближе кући, први принцип експеримента је утврђивањестрогост експерименталне логике.

Циљни узоракодноси се на узорак који захтева да детектујемо циљни ген након одређеног третмана.Референтни узоракје узорак без икаквог третмана, који се у биологији често назива дивљим типом.

Експериментални реплициранису веома важни.Генерално, број убедљивих понављања мора бити већи од три.Неопходно је разликовати шта је биолошка, а шта техничка репликација.

Биолошке реплике: Исти верификациони експеримент изведен са различитим материјалима (време, биљке, серије, реакционе плоче).

Биолошко умножавање
Узмимо за пример третман бибера пестицидима.Урадите исто за Б и Ц.

Техничке реплике (техничке реплике): То је поновљени експеримент дизајниран да избегне грешке изазване операцијом, што је заправо дупла рупа укључена у исти материјал.И третмани и контроле морају имати подешавања реплицирања (минимално три) циљног гена и интерног референтног гена.

Техничко понављање
Поново узмимо за пример бибер третиран пестицидима.За контролу биљке А групе се такође третирају на исти начин.Слично, урадите исти третман за биљке Б и Ц.Ово је техничко понављање.

Вреди напоменути да

Негативне контроле—НТЦ и НРТ
НТЦ (Контрола без шаблона), контрола без шаблона, користи се за проверу да ли је експериментални материјал контаминиран.Генерално, вода се користи као шаблон.Ако постоји флуоресцентна реакција, то указује да је у лабораторији дошло до контаминације нуклеинском киселином.

Ова загађења потичу од: нечисте воде, неквалификовани реагенси који садрже ендогени ДНК, загађење темељног загађења, загађење лабораторијске опреме, загађење аеросола итд., Потребно је користити инхибиторе и инхибиторе РНсе.Аеросолно загађење је најтеже пронаћи.Замислите да је ваша лабораторија попут смога, са разним нуклеинским киселинама суспендованим у ваздуху.

НРТ (без реверзне транскриптазе), контрола без реверзне транскрипције, је нереверзно транскрибована РНК као негативна контрола, што је контрола остатка гДНК.

Када се врши експресија гена, количина РНК се детектује детекцијом количине цДНК након реверзне транскрипције.Ако је остатак ГДНА када је РНА пречишћена, то ће проузроковати грешке у експерименталним резултатима, јер су стварни добијени резултати ГДНА и цДНА.На агрегатном нивоу, не само цДНК, гДНК треба потпуно уклонити током екстракције РНК.

МИКЕ (2)—узорак информација
Такозване информације о узорку значи да када објавимо чланак о КПЦР-у, морамо јасно објаснити информације о узорку, што је неопходан део чланка.Слично томе, када обрађујемо узорке, такође морамо регулисати сопствене операције како бисмо осигурали валидност узорака.

Опис узорка је само резултат, а више пажње треба посветити материјалима узетим током целог експеримента.

Избор експерименталних материјала
Узорци крви – бирајте свежу крв, не дуже од 4 сата.Узорци ћелија – изаберите прикупљање свежих ћелија у периоду снажног раста.Животињско ткиво—Бирајте свеже ткиво које интензивно расте.Биљно ткиво – Бирајте свеже, младо ткиво.

Сигурно сте приметили да у ових неколико реченица постоји кључна реч: свеж .
За горе наведене узорке, најбољи, економични и стабилни комплет на тржишту је предвиђени комплет, који може брзо и лако извући њихов ДНК и РНА.

Мини комплет за ДНК крви

Комплет за изолацију укупне РНК ћелија

Комплет за изолацију укупне РНК животиња

Комплет за изолацију укупне РНК биљака

Комплет за изолацију укупне РНК биљака Плус

Комплет за изолацију ДНК биљака

Складиштење експерименталног материјала
Уопштено говорећи, не препоручујемо чување узорака, ако услови дозвољавају.Међутим, постоји много пријатеља који не могу да спроведу експерименте одмах након узорковања, а неке чак и требају пренијети течне тенкове за азот на поље за узорковање.

За оваквог вредног пријатеља могу само да кажем да се не разумете у потрошни материјал реагенса.Сада многе компаније за потрошњу реагенса производе реагенсе који могу да чувају узорке РНК на собној температури, а ви можете изабрати да их користите.Конвенционална метода складиштења је складиштење течног азота, коришћењем малог резервоара за течни азот који се лако преноси.Након што се узорак врати у лабораторију, чувајте га у фрижидеру на -80°Ц.

За експерименте који укључују РНК, мора се поштовати принцип од шест речи:ниска температура, без ензима,ибрзо .

Концепт ниске температуре је лако разумети;Без ензима, РНасе је свуда у свету у којем живимо (у супротном, убили бисте ХИВ-ом), па како избећи Рнасе када је експериментални концепт врло важан концепт.брзо,Не постоји Кунг Фу на свету који се не може сломити, само брзина се не може сломити.

Стога, у извесном смислу, што је краће време екстракције, то је комплет бољи.ЗаштоФорегене'с кит наглашавају брзину, јер то добро знају.

ПС: Неке девојке веома пажљиво раде експерименте, али нису тако добри као закуцавање после неколико година рада.Они осећају да је Бог неправедан, жале се на друге и траже живот.У ствари, она то није разумела.Није добро заштитио РНА, а играч закуцавања је био окретан.Када је радио експеримент, мислио је да ће довршити закуцавање Слам са три пута, пет пута и две дивизије, али је добро урадио експеримент.

Белешка: Спорије, веће шансе за инвазију РНасе.Како да се обучите да будете брзи?Нема шансе, само вежбајте више.

За различите експерименте и различите узорке ипак је потребно прочитати више литературе и одабрати одговарајући метод обраде.За процес прикупљања и складиштења у узорку, МИКЕ захтева да се мора јасно писати у раду, тако да рецензенти могу да прегледају поузданост папира, а такође је прикладно за омамљени младићи да понове ваш експеримент.

Иако су биолошки експерименти тешки, они су врхунски.Ако нисте пажљиви, можете преврнути свет.На пример, претварање САРС-а у биохемијску кризу, или прављење хибридног пиринча да би се спасило 1,3 милијарде људи.Слика у наставку је хемијски експеримент, требало би да разумете колико сте поносни од свог истраживања само гледајући његов изглед сличан курац.Заборави, не црни га.

МИКЕ (3) – екстракција нуклеинске киселине.
Екстракција нуклеинске киселине је велики догађај, а сви експерименти молекуларне биологије почињу екстракцијом нуклеинске киселине.Пре свега, копирајмо МИКЕ-ов садржај о екстракцији нуклеинске киселине.

Гледајући овај образац, не можете остати на површини.Форма је догма.Да бисте били врхунски студент, морате се запитати зашто.Суштински садржај ове табеле је: Прогончистоћу, интегритет, конзистентност и екстракциону количину РНК .

Први деопроцес или инструмент је корак екстракције нуклеинске киселине.Ако користите аутоматски екстрактор нуклеинске киселине да бисте извукли (напредно, контактирајте ме за куповину), морате да наведете назив модела инструмента.

Назив комплета и

који комплет је коришћен за детаље промене, који специјални реагенси су додати или које специјалне операције су урађене треба јасно објаснити како би други могли лако да понове ваш експеримент.

Неки људи додају неке посебне реагенсе приликом вађења специјалних узорака, мислећи да је то њихово тајно оружје и не говоре другима.Док то држе у тајности, они такође губе прилику да ваш чланак заблиста.Не будите паметни, морате бити поштенији од земље стари Зханг у научној истраживању, ако желите да будете паметни, чланак ће вас учинити глупом.

морате запамтити број производа у комплетукада наручите комплет и напишете чланак.Ове генерално постоје два броја на комплету: Цат-Каталошки број (број производа, број чланака), број лотова за лот-производ (користи се за означавање ког серије произшао).

Поред тога, број ЦАС се често користи приликом наручивања биохемијских реагенса и ја ћу га популарисати заједно.ЦАС број је број који Америчко хемијско друштво даје сваком новом хемијском леку.Генерално, три броја су повезана цртицом.Русхуи-јев ЦАС број: 7732-18-5.Хемикалије често имају више алијаса, али ЦАС број је јединствен.Када наручите лек, прво можете да проверите његов ЦАС број.

Ближе кући, зашто морамо јасно да описујемо ове ствари?У ствари, то је и провера квалитета екстракције РНК.Употреба инструмената и комплета ће учинити екстракцију РНК конзистентнијом.Скала екстракције обичних лабораторија није велика и може се набавити помоћу комплета.

Детаљи третмана ДНазом или РНКазом
Важно питање флуоресцентног квантитативног ПЦР-а је спречавање контаминације ДНК и немојте експериментисати ако постоји контаминација.Стога је неопходно навести процес који сте користили за обраду ДНК, како бисте демонстрирали да је ДНК у експерименталном процесу потпуно уклоњена.представљена шематским дијаграмом.

Шематски дијаграм РНК и ДНК
Генерално, метод за уклањање ДНК је третирање РНК са ДНазом након екстракције.Међутим, ово су релативно старе методе.Комерцијални комплети за екстракцију РНК су били у стању да уклоне ДНК током процеса екстракције без додавања ДНазе.На пример, серија комплета из Форегене.

Белешка: Уклањање ДНК током екстракције РНК је веома опасан мач са две оштрице, који ће продужити време операције екстракције РНК и повећати ризик од деградације РНК.У основи, то је компромис између приноса РНК и чистоће.

Поред тога, количина ДНАСЕ додаје се у колони за адсорпцију на силицијума је врло мала, а висококвалитетна Днасе мора се користити за постизање ефекта.Неоптимизована ДНаза се не може брзо и потпуно сварити.Ово је тест техничког нивоа трговца.Наравно, има још чуднијих трговаца који се хвале да се ДНК може уклонити без ДНазе.Може се рећи да је хулиган свако ко се хвали да се ДНК може потпуно уклонити без ДНазе.ДНК је релативно стабилна дволанчана структура и не може се избрисати само разговором и смехом.

Процена контаминације
метода процене: детекција електрофорезом, 1% агароза, 6В/цм, 15мин, пуњење 1-3 ул

Квантитативна анализа нуклеинске киселине
се обично мери помоћу УВ спектрофотометра.Дозволите ми да прво популаризујем значење три вредности ОД260, ОД280 и ОД230.
·ОД260нм: То је апсорпциона таласна дужина највишег апсорпционог врха нуклеинске киселине, а најбоља измерена вредност се креће од 0,1 до 1,0.Ако није, разблажите или концентришите узорак да бисте га довели у домет.
·ОД280нм: То је таласна дужина апсорпције највећег апсорпционог врха протеина и фенолних супстанци.
·ОД230нм: То је таласна дужина апсорпције највећег апсорпционог врха угљених хидрата.

Затим, хајде да причамо о улози сваког индикатора.За А260 може се користити за мерење приноса нуклеинске киселине.Када ОД260 = 1, ДСДНА = 50μг / мЛ, ССДНА = 37μг / мл, РНА = 40μг / мл.

За чистоћу, морамо да погледамо односе које обично видимо: ОД260/280 и ОД260/230.
·Чиста ДНК: ОД260/280 је приближно једнак 1,8.Када је већи од 1.9, то указује да постоји РНА загађење и када је мање од 1.6, то указује да постоји протеин и фенол загађење.
·Чиста РНК: 1.7
· Од260 / 230: Да ли је то ДНК или РНА, референтна вредност је 2,5.Када је мање од 2.0, то указује да постоји загађење шећера, соли и органских материја.

интегритет РНК

Веома је важно измерити интегритет РНА.Генерално, неопходно је урадити експеримент денатурације РНК у гелу да би се проверило да ли је сјај између 28С и 18С РНК двоструки однос.Када се појави трећи опсег 5, то значи да је РНА почела да деградира, осим бескраљежњака.

Подаци за процену квалитета РНК: Поред наведених тестова, постоје и неки напреднији инструментални тестови у погледу интегритета РНК, као што је РКИ тест интегритета система за аутоматску електрофорезу Екперион, који може да открије да ли се РНК невидљиво разграђује.

У научном истраживању флуоресцентни квантитативни ПЦР је поређење између циљног гена и интерног референтног гена.Стога је у процесу очувања узорака РНА, екстракција РНА итд., Основни циљ је осигурати интегритет РНА.

Како интегритет РНА утиче на равнотежу између циљног гена и интерни референтни ген се може лако разумети са слике у наставку.Деградација ће довести до непотпуности гена, било да је у питању некомплетност интерног референтног гена или некомплетност циљног гена, то ће имати велики утицај на податке.

Шематски дијаграм циљног гена и референтног гена, не сме бити истинит

Тест инхибиције (да ли је ЦТ вредност потиснута под високим или ниским концентрацијама или другим условима)

Склапање ове цифре као пример, ЦТ вредности пет кривина су следеће.Расподела ЦТ вредности између кривих је неуједначена, а вредности Цт касне под високим и ниским концентрацијама, што је случај ПЦР инхибиције.

Кључна тачка: У процесу екстракције РНА морамо да напустимо заблуде и успостављамо исправне.

Погрешна идеја је: екстракција РНА траје само принос, мислећи да је то већа количина РНА добијена, то је боље.У ствари, када радимо квантификацију, ако број гена није баш велик, не треба нам много РНА.Количина РНА која извучете је више него довољна.

Исправан концепт је:Екстракција РНК треба да тежи чистоћи, интегритету и доследности.Чистоћа може осигурати да накнадна реверзна транскрипција није инхибирана и да ДНК неће утицати на податке.Интегритет обезбеђује равнотежу циљних секвенци и интерних референци.Конзистентност обезбеђује стабилно пуњење узорка.

МИКЕ (4) – реверзна транскрипција
Мисцонцептион: тежња за већом запремином узорка.
Исправан концепт: Пратите доследност (стабилност), без обзира на количину напуњене РНК, ефикасност реверзне транскрипције остаје конзистентна, обезбеђујући да разлике у цДНК заиста могу да одражавају разлике у мРНК.
Овај процес објашњавамо шематским дијаграмом:

Шематски дијаграм ефикасности реверзне транскрипције, није тачан
Пре свега, морамо разумети разлику између процеса реверзне транскрипције и ПЦР процеса.ПЦР се подвргава вишеструким процесима загревања и жарења, а циљни фрагмент расте експоненцијално;док реверзна транскрипција нема овај процес, можемо замислити да је реверзна транскрипција заправо један на један. Током процеса репликације, онолико делова РНК

пошто постоји може добити што више делова цДНК Информације, то би требало да буде схваћено до сада, јер су велики и мали фрагменти реверзно транскрибовани и немогуће је фокусирати се на један фрагмент.А пошто је количина РНК релативно мала, количина добијене цДНК је такође релативно мала, за разлику од ПЦР-а који има ефекат амплификације, па га је у суштини немогуће открити.

Резултати цДНК електрофорезе
Друго, у идеалном случају, реверзна транскрипција се изводи један на један, али ниједна реверзна транскриптаза било које компаније не може постићи овај ефекат.У основи, ефикасност већине реверзних транскриптаза се креће између 30-50%.Ако је то случај, радије бисмо имали релативно стабилну ефикасност реверзне транскрипције, што желимо да видимо на слици: 3 РНК добијају 2 цДНК, 6 РНК добијају 4 цДНК, тако да без обзира колико је узорак учитан, ефикасност реверзне транскрипције је релативно стабилна.Не желимо да видимо ситуацију у којој је ефикасност реверзне транскрипције нестабилна и висока концентрација инхибирана.

Дакле, како проверити да ли је ефикасност реверзне транскрипције стабилна?Метода је веома једноставна, потребно је само да урадите упоредни тест: један је да извршите реверзну транскрипцију у цДНК након удвострученог разблаживања РНК, а други је да направите дупло разблаживање након реверзне транскрипције у цДНК, а затим урадите кПЦР да видите добијени нагиб Да ли је конзистентан.Као врхунски студент, требало би да то разумете за неколико секунди.Како је приказано испод:

Разблаживање РНК и цДНК да би се проверило да ли је ефикасност реверзне транскрипције стабилна
Реверзна транскриптаза и комплет
Како савршени флуоресцентни квантитативни ПЦР може имати одличну реверзну транскриптазу и комплет.Реверзна транскриптаза се грубо дели на два типа према извору, АМВ илиМ-МЛВ, а њихов учинак је исти као приказан у табели.

Активност РНазе Х
РНаза Х је рибонуклеаза Х, кинески назив је рибонуклеаза Х, што је ендорибонуклеаза која може специфично хидролизовати РНК у хибридном ланцу ДНК-РНА.РНаза Х не може да хидролизује фосфодиестарске везе у једноланчаној или дволанчаној ДНК или РНК, односно не може да свари једноланчану или дволанчану ДНК или РНК.Обично се користи у синтези другог ланца цДНК.

То је чудна ствар.Кажемо да реверзна транскриптаза има активност РНазе Х, а не да реверзна транскриптаза садржи РНазу Х, и можда неће бити могуће одвојити РНазу Х од реверзне транскриптазе, можда због конформације одређених група у реверзној транскриптази. Ова активност је узрокована реверзном транскриптазом.

Стога, без обзира на већу ефикасност реверзне транскрипције АМВ, његова активност РНазе Х смањује принос цДНК.Наравно, произвођачи реагенса стално оптимизују своје производе како би елиминисали активност РНазе Х у реверзној транскриптази што је више могуће како би повећали принос цДНК.
Температура жарења

Секундарна структура РНК на различитим температурама
Погледајте горњу слику за секундарну структуру РНК на различитим температурама и користите мФолд онлајн алат да одредите секундарну структуру циљног фрагмента под одређеним условима температуре и концентрације соли.На 55°Ц, секундарна структура РНК је и даље веома сложена, реверзна транскриптаза не може да функционише, а секундарна структура се не може потпуно разрешити до 65°Ц, док је оптимална температура АМВ и М-МЛВ далеко нижа од ове температуре.
шта да радим?Секундарна структура је комплементарно упаривање самог шаблона, што доводи до јаке конкуренције између прајмера и реверзне транскриптазе и шаблона, што резултира низом проблема као што су низак Е и лоша поновљивост.

шта да радим?Само повећајте температуру жарења што је више могуће.

Многи произвођачи реагенса побољшавају своју реверзну транскриптазу путем генетског инжењеринга.Неки повећавају температуру реакције, као што су Јифан и Аиделаи, а неки уклањају активну групу ензима РНасе Х да би побољшали афинитет између ензима и РНК шаблона.Висок афинитет може конкурентно истиснути секундарну структуру и несметано читати, а такође у великој мери побољшати ефикасност реверзне транскрипције.
Кључна тачка: Реверзна транскрипција је важнија за постизање конзистентности ефикасности реверзне транскрипције (ензими не само да морају бити ефикасни већ и стабилни), него за количину учитаног узорка, ако то није флуоресцентни квантитативни ПЦР посебно великих размера, то уопште неће бити могуће.Вишеструке цДНК.
Разни произвођачи су такође уложили неке напоре у потрази за доследношћу.На пример, већина компанија сада има упаковану обрнуту транскрипцију као стандардни комплет за продају, што је добар избор.
На пример, Форегене-ови РТ Еаси Сериес комплети:

РТ Еаси И (Мастер премикс за комплет за синтезу цДНК првог ланца)

МИКЕ (5) – информација о циљном гену

Горња слика објашњава
1. Да ли је овај ген ефикасан за поновљене експерименте генерално се може проверити поновљеним експериментима.
2. ИД гена, знаш.
3. Дужина гена, укупна дужина циљног гена дефинитивно није проблем.Када дизајнирате прајмере, уверите се да је дужина ампликона између 80-200бп да бисте обезбедили бољу ефикасност амплификације.
4. Информације о поређењу секвенце, циљни ген треба да се упореди у банци гена да би се спречило неспецифично појачање.
5. Присуство псеудогена.Псеудоген је ДНК секвенца слична нормалном гену, али губи своју нормалну функцију.Често постоји у породици еукариота са више гена.Обично се представља са ψ.То је нефункционална копија геномске ДНК у геному која је веома слична секвенци кодирајућег гена., углавном се не транскрибују и немају јасно физиолошко значење.
6. Положај прајмера у односу на егзоне и интроне.У раним годинама, када смо решавали проблем контаминације ДНК, често смо обраћали пажњу на положаје прајмера, егзона и интрона, и генерално разматрали дизајнирање прајмера преко интрона како бисмо избегли амплификацију ДНК.Молимо погледајте слику испод: црна представља интроне, разне плаве представљају егзоне, ружичаста представљају уобичајене прајмере, а светло црвена представља прајмере који се протежу кроз интроне.

Шематски, никад истинито
Какав савршен план изгледа, али у ствари, у већини случајева, транс-интронски прајмери ​​нису тако магични као што се замишља, а такође ће изазвати неспецифично појачање.Дакле, најбољи начин да се спречи контаминација ДНК је потпуно уклањање ДНК.
7. Предвиђање конформације.Поново користећи овај пример, користите онлине алатку мФолд да бисте одредили секундарну структуру циљног фрагмента на одређеној температури и концентрацији соли.

Секундарна структура РНК на различитим температурама
Секундарна структура је комплементарно упаривање самог шаблона, што ће довести до јаке конкуренције између прајмера и упаривања шаблона, а шансе за везивање прајмера су мање, што резултира низом проблема као што је низак Е и лоша поновљивост.Кроз софтверско предвиђање, ако нема проблема са секундарном структуром, то би било сјајно.Ако постоји, наш следећи чланак ће посебно говорити о томе како да решите овај проблем.

МИКЕ (6)—кПЦР олигонуклеотиди

За флуоресцентни квантитативни ПЦР, прва ствар са којом се свакодневно борите је екстракција РНК, а друга ствар може бити дизајн прајмера.
Пре свега, још увек проверавамо правила о дизајну прајмера према МИКЕ контролној листи.Толико је једноставно да олоши могу да се смеју, а ми то можемо да завршимо у једној реченици: сазнајте редослед и положај сонде прајмера и начин модификације.За метод пречишћавања прајмера, синтеза прајмера је тренутно толико јефтина, кПЦР је вредан ПАГЕ и изнад метода пречишћавања, а информације о инструменту за синтезу нису важне.Многи људи већ деценијама раде прајмере и не знају да је синтисајзер АБИ3900.
Што се тиче принципа дизајна прајмера, не морате да их памтите напамет, јер већина софтвера за дизајн буквара или онлајн алата може да реши ове проблеме (препоручени онлајн алат пример3.ут.ее/), а 99,999% дизајна буквара се не ради ручно. Видите, аутор понекад дизајнира стотине буквара дневно, ако читате један по један, то ће постати унакрсно.
Само проверите следеће тачке након што су прајмери ​​дизајнирани:
1. Дизајнирајте прајмере близу 3′ краја: У случају коришћења олиго дТ прајмера за синтезу првог ланца цДНК, с обзиром на ефикасност реверзне транскрипције и интегритет РНК, пројектовани прајмери ​​треба да буду дизајнирани близу 3′ краја да би се побољшала ефикасност амплификације.Користите слику да објасните следеће (не постоји начин да се ово разуме):

Зашто би прајмери ​​требали бити дизајнирани близу краја 3′, то не сме бити тачно
2. ТМ вредност: Тм вредност је на 55-65°Ц (јер је активност егзонуклеазе највећа на 60°Ц), а садржај ГЦ је на 40%-60%.
3. БЛАСТ: Да би се избегла неспецифична амплификација генома, Бласт се мора користити за додатну верификацију.

МИКЕ(7)—кПЦР процес

1. кПЦР комплет
У складу са захтевима МИКЕ-а, морамо јасно описати комплетне услове реакције у чланку, укључујући конфигурацију ПЦР реакционог система, који комплет се користи, ко је произвођач, колики је реакциони систем, да ли се користи метод бојења или метода сонде, подешавања ПЦР програма.Возачи ветерани ће дефинитивно открити да све док је комплет одабран, горње информације су у основи одређене.
Тренутно је производња и производња флуоресцентних квантитативних ПЦР комплета веома зрела технологија.Све док не изаберете изузетно лоше произвођаче, вероватноћа проблема није велика, али ипак желимо да поделимо са вама неколико тачака:
Хот-старт Так ензим:Најважнији део ПЦР-а је Так ензим са врућим стартом.Ензими са врућим стартом на тржишту су генерално подељени у два типа, један је хемијски модификовани ензим врућег покретања (можете га замислити као уграђивање парафина), а други је ензим за покретање загревања за модификацију антитела (везивање антиген-антитело).Хемијска модификација је рани начин покретања ензима у врућем стању.Када се достигне одређена температура, ензим ће ослободити своју активност.Ензим за врући старт модификован антителом користи биолошке методе да блокира активност ензима.Када се достигне одређена температура, антитело ће бити денатурисано и инактивирано као протеин, а активност ензима ће се активирати.

Међутим, каква је корист од овога?Ово је случај, активност ослобађања ензима модификованих антителом је бржа него код хемијски модификованих ензима, тако да у погледу осетљивости ензими модификовани антителом имају благу предност, тако да у основи нема хемијски модификованих ензима у комплетима на тржишту.Ако постоји, онда је технологија овог произвођача још увек заглављена у ери миленијума.
Концентрација јона магнезијума:Концентрација јона магнезијума је веома важна у ПЦР реакцији.Одговарајућа концентрација јона магнезијума може подстаћи ослобађање активности Так ензима.Ако је концентрација прениска, активност ензима ће бити значајно смањена;ако је концентрација превисока, ензимски катализована неспецифична амплификација ће бити појачана.Концентрација јона магнезијума ће такође утицати на жарење прајмера, температуру топљења шаблона и ПЦР производа, чиме ће утицати на принос амплификованих фрагмената.Концентрација јона магнезијума се генерално контролише на 25 мМ.Наравно, за добар комплет, концентрација магнезијумових јона мора бити добро контролисана.Неки трговци додају агенс за хелирање магнезијумових јона у реагенс, који може постићи ефекат аутоматског подешавања концентрације магнезијумових јона.
Концентрација флуоресцентне боје:Флуоресцентна боја, која је СИБР Греен коју обично користимо, углавном генерише флуоресценцију везивањем за мањи жлеб дволанчане ДНК, јер је везивање боје за дволанчану ДНК неспецифично, то јест све док се дволанчана ДНК може комбиновати са њом, тако ће се флуоресцентни систем комбиновати са њом, тако да ће се флуоресцентни систем комбиновати са ДНК шаблоном. позадински сигнал.
ПС: Због својих особина осетљивих на светлост, производи на тржишту се углавном пакују у смеђе непрозирне епрувете за центрифугирање (као што је приказано на слици испод).Међутим, ово ће наићи на проблем.Тешко је видети да ли је течност усисана приликом узорковања.У том погледу, Кингке је заиста најприкладнији за употребу (као што је приказано на слици испод), а провидна цев је упакована у непрозирну лимену кесу.Затим га ставите у лимену кесу, узимајући у обзир погодност избегавања светлости и узорковања.Морате одабрати прави број производа.ТСЕ204 је супер исплатива егзистенција, због чега желим да садим траву.

Концентрација флуоресцентне боје је такође веома важна.Ако је концентрација прениска, крива појачања неће расти у каснијој фази и није савршена;ако је концентрација превисока, то ће изазвати сметње буке.Пошто флуоресцентни квантитативни ПЦР углавном зависи од ЦТ вредности, ако концентрација флуоресцентне боје није правилно подешена, ниска тачка је боља од горње тачке.Наравно, одговарајућа концентрација боје је најбоља.

РОКС: РОКС боје се користе за исправљање грешака сигнала флуоресценције од бунара до бунара.Неки произвођачи инструмената захтевају калибрацију, док други не.На пример, коришћење Тхермо Фисхер Сциентифиц ПЦР инструмента за појачавање у реалном времену обично захтева калибрацију, укључујући 7300, 7500, 7500Фаст, СтепОнеПлус, итд. Општа упутства за комплет ће то описати.
Форегене-ов кПЦР Мик такође садржи РОКС боју, која је погодна за употребу у различитим моделима.

Реал Тиме ПЦР Кит-Такман

Третман слабом водоничном везом: Третман слабих водоничних веза је релативно техничка ствар.Ништа није прочитало приручнике многих комплета, али ниједан од њих није поменуо ову тему.У ствари, толико је важно.Комбинација база углавном зависи од јачине водоничних веза.Јаке водоничне везе су нормално појачање, а слабе водоничне везе доводе до неспецифичног појачања.Ако се слабе водоничне везе не могу добро елиминисати, неспецифично појачање се не може избећи.У оквиру аутора, само неколико компанија је приметило овај проблем.Када купујете комплет, можете се осврнути на то да ли сте разматрали решење у овом погледу за комплет који желите да изаберете.

Волумен реакције: Систем од 20-50ул се чешће користи, а мање количине ће вероватно изазвати грешке.Уопштено говорећи, упутства за комплет ће препоручити употребу запремина ПЦР реакције.Немојте бити паметни и користите мање количине да бисте уштедели трошкове.циљ од.Обим који су препоручили трговци је заправо тестиран и може се десити да не могу да реше проблем грешака изазваних малим количинама.
2. Произвођач и број артикла цевне плоче
Сви знају принцип флуоресцентног квантитативног ПЦР-а.Сакупљање флуоресценције се углавном врши преко ПЦР капица епрувета.Када бирате потрошни материјал за ПЦР, обратите пажњу на две тачке: добар пренос светлости и погодан за инструмент.Уопштено говорећи, плоче и цеви мејнстрим брендова су у реду, али морате пажљиво да бирате у погледу прилагођавања, иначе нећете моћи да користите инструмент.

4. Највиши ниво знања

МИКЕ (8)—кПЦР валидација
Ово је главни приоритет кПЦР-а!Толики хероји су овде пали у песак.Наравно, могуће је и да имате среће и да су гени које сте проучавали једноставни, па сте плутали кроз ледену пећину уз ветар.Верификационе информације кПЦР-а имају за циљ да тестирају поузданост података.Ми наводимо неопходне информације за верификацију на следећи начин:

1.Тест специфичности
Специфичност амплификације циљног гена се тестира провером да ли је слика електрофорезе једнострука;верификација секвенцирања;крива топљења да би се видело да ли је мапа врхова једнострука;проверу варења ензима и друге методе.
Овде се фокусирамо на танализа неспецифичне амплификације методом криве топљења.Уопштено говорећи, када дизајнирамо прајмере, потребно је да величина фрагмента производа буде у опсегу од 80-200 бп, што чини температуру топљења ПЦР производа у опсегу од 80-85 °Ц.Стога, ако постоје различити пикови, морају постојати и други неспецифични производи амплификације;ако се врх појави испод 80°Ц, генерално се сматра да је прајмер димер;ако се врх појави изнад 85°Ц, генерално се сматра да је то контаминација ДНК или више неспецифичне амплификације великих фрагмената.
Напомена: Понекад постоји само један врх на 80°Ц.У овом тренутку, овај концепт се мора придржавати.Вероватно је да су резултати амплификације сви димери прајмера.

Нормална крива топљења (један врх без неспецифичног појачања)

Проблематична крива топљења (неспецифично појачање лажних пикова)
【Анализа случаја】

Постоји главни врх, али димер прајмера је озбиљан
Крива топљења са једним врхом на слици испод може лако да завара ваше очи, мислећи да је то савршен експеримент, али резултат је потпуно погрешан.У овом тренутку, морамо погледати температуру топљења.Максимална температура је испод 80°Ц, што је потпуно прајмер-димер.

Нема циљаног фрагмента, сви димери прајмера
Ево, мој брат не може да стане.Слика испод је фотографија снимљена мобилним телефоном који ми је послао један олош.Реагенси које је користио су сви уобичајени брендови у индустрији.Прешао је са једног бренда Т-префикса на други бренд са Т-префиксом.Мислим да сте већ погодили.Олош ми је завапио: „Реагенс који се користи на првој слици је предобар, а врх је један.Касније, након употребе реагенса који сте препоручили, постаје као на другој слици, са помешаним врховима.Учинио си ме несрећним.“
Одвојите два графикона.На први поглед, један има један врх, а други двоструки врх.Глупости, један врх је наравно у реду.Је ли то истина?
Горе од Доу Е, ако ставим две слике на слику испод, одмах ћете разумети.У ствари, оваква слика нас лако паралише.Након пажљиве анализе, открили смо да: врх прве фигуре је на 75°Ц, што је потпуно прајмер димер;врх друге фигуре се појављује на 75°Ц и 82°Ц, барем постоје. Производ се појављује.

Слике повратних информација ученика
Дакле, основни проблем није проблем реагенса, већ проблем дизајна прајмера.У исто време, то такође доказује да неки велики брендови нису квалитетног гвожђа, а такође доказује и оно што је мој брат раније рекао: Није бренд реагенса тај који подржава ваш чланак.Ваш чланак је подржао бренд реагенса.Замислите само, да олош није променио реагенсе, погрешни подаци би били послати у часопис, а оно што би се десило била би трагедија.
2. Цт вредност празне контроле
Не објашњавајте, ако празна контрола има вредност Цт, зар није загађење?Међутим, још увек морате да разумете која празна контрола има Цт вредност.Ако је НТЦ, то значи да постоји страна ДНК као што је контаминација реагенсом.Ако је НРТ, то значи да екстрахована РНК има контаминацију ДНК.
3. Стандардна крива
Укључујући формулу нагиба и прорачуна, ефикасност ПЦР-а се може израчунати преко формуле.Савршен експеримент захтева да се нагиб стандардне криве приближи 3,32, а Р² да се приближи 0,9999.
4. Линеарни динамички опсег
Динамички опсег реакције је линеаран.Према шаблону који се користи за генерисање стандардне криве, динамички опсег треба да садржи најмање 5 градијента концентрације и обратите пажњу на промену вредности Цт при високим градијентима концентрације и ниским градијентима концентрације.
5. Тачност детекције
Промене у кПЦР резултатима, односно лоша поновљивост, односно слаба прецизност, узроковане су многим факторима, укључујући температуру, концентрацију и рад.Прецизност кПЦР-а генерално постаје мање подложна контроли како се број копија смањује.Идеално унутар експерименталне варијације, ова техничка варијација треба да се разликује од биолошке варијације, а биолошке реплике могу директно да се позабаве статистичким разликама у кПЦР резултатима између група или третмана.Посебно за дијагностичке тестове, мора се пријавити најбоља прецизност међу тестовима (поновљивост) на свим локацијама и оператерима.
6. Ефикасност детекције и ЛОД (у мултиплексу кПЦР)
ЛОД је најнижа концентрација од 95% откривених позитивних узорака.Другим речима, концентрација ЛОД садржана у сету реплика циљног гена не би требало да пређе 5% неуспешних реакција.Када се ради мултиплекс кПЦР анализа, посебно за истовремену детекцију тачкастих мутација или полиморфизама, мултиплекс кПЦР треба да обезбеди доказ да тачност вишеструких циљних фрагмената није угрожена у истој епрувети, вишеструка детекција и детекција у једној епрувети. Ефикасност и ЛОД треба да буду исти.Нарочито када се истовремено појачавају циљни гени високе концентрације и циљни гени ниске концентрације, овом проблему се мора обратити пажња.
Проблеми и решењаУопштено говорећи, проблеми који се често сусрећу у кПЦР отклањању грешака фокусирају се на следеће аспекте:
·неспецифично појачање
·Тежак избор концентрације прајмера и проблеми са прајмер-димерима
· Температура жарења је нетачна
· Секундарна структура утиче на ефикасност појачања
неспецифично појачање
неспецифично појачањесе обично сматра да ли дизајн прајмера није прикладан, али ако не журите да промените прајмере, прво можете да испробате следеће методе (принцип је такође приложен):
·Повећајте температуру жарења – покушајте да слабе водоничне везе не могу да се одрже;
· Скратити време жарења и истезања – смањити могућност слабих водоничних веза;
·Смањити концентрацију прајмера – смањити могућност везивања сувишних прајмера и нециљаних региона;
Ниска ефикасност појачања
Ситуација супротна од неспецифичног појачања – ниска ефикасност појачања, а мере за решавање ниске ефикасности појачања су управо супротне:
· Продужите време жарења и истезања;
· Пређите на ПЦР у три корака и смањите температуру жарења;
· Повећати концентрацију прајмера;
Ps: Многи дипломирани студенти рођени 90-их не желе да уче како да отклањају грешке у експериментима и надају се да комплет може у потпуности решити проблем (ако желите да одете у компанију реагенса да се бави истраживањем и развојем након дипломирања), у ствари, произвођачи реагенса такође мисле на овај начин, надам се да је будала Може се користити када га добијете, тако да је много труда реагенса утрошено на решавање проблема неспецифичних реагенса. слаби фактори апсорпције Х-везе.Да би лако решили проблем, будале ипак морају да прочитају увод компаније за реагенс да виде да ли постоји фактор који апсорбује слабе водоничне везе.
Тежак избор концентрације прајмера и проблеми са прајмер-димерима
Метод 1: Уопштено говорећи, упутства комплета за кПЦР имају препоручене системе и препоручене концентрације прајмера.
Метод 2: Отклањање грешака подешавањем градијента концентрације прајмера.Слика испод је украдена из компаније ради илустрације.Слика испод приказује квантитативне резултате флуоресценције направљене са три градијента концентрације прајмера (100нМ, 250нМ, 500нМ) и четири градијента концентрације шаблона (0.1нг, 1нг, 10нг, 100нг).Вредност Цт експерименталних резултата је приказана на следећи начин:

Избор концентрације прајмера Спојите сваку концентрацију прајмера у линију на следећи начин:

Избор концентрације прајмера је очигледан, линеарни однос концентрације прајмера од 100нМ и 250нМ је бољи, а линеарни однос концентрације прајмера од 500нМ је релативно лош.Код 100нМ и 250нМ, вредност Цт од 250нМ је релативно мала, тако да је оптимална концентрација прајмера 250нМ.Генерално, јаки прајмер-димери се могу видети на кривој топљења.Шта ако дизајнирани прајмери ​​не могу да избегну прајмер-димере?
Метод 3: Смањите количину прајмера и повећајте температуру жарења (нема потребе да се објашњава).
Емпиријска вредност температуре жарења је 60°Ц.Ако нисте сигурни, како одабрати прикладнију температуру жарења?Одговор је исти као и избор концентрације прајмера -градијент тест.Снимите слику компаније Био-рад да илуструјете проблем.За амплификацију одређеног циљног фрагмента, подесите осам температурних градијената, сваки са три понављања, а добијена крива амплификације је следећа:

избор температуре жарења:
·70°Ц, 69°Ц—У основи, прајмери ​​се не могу комбиновати, тако да нема амплификације.
·67,3°Ц – Постоји мала количина појачања на почетку, а вредност Цт је релативно велика.
·64,5°Ц——Цт вредност се смањује.
·На 60,7°Ц, 58,0°Ц, 56,2°Ц и 55,0°Ц, вредности Цт су у основи имале тенденцију да буду стабилне, али су коначне вредности флуоресценције биле различите.
Како одабрати?Принцип: Први принцип је већа Цт вредност.За исту вредност Цт, изаберите вишу температуру жарења да бисте избегли димеризацију и неспецифично појачање.Иако постоји већа вредност флуоресценције на 55°Ц, у њој могу бити димери или неспецифична амплификација.
Али ако сте паметни као ви, сигурно ћете помислити: Логично гледано, ако је ПЦР реакција веома специфична, све док концентрација прајмера прелази минимални захтев, високе и ниске тачке не би требало да имају ефекта, баш као флуоресцентне боје и дНТП.Заиста, све док је температура жарења правилно оптимизована, ефекат концентрације прајмера на вредност Цт ће природно бити минимизиран.

Температура жарења је правилно оптимизована, а ефекат концентрације прајмера на ЦТ биће минимизиран
Секундарна структура утиче на ефикасност амплификације
Узмимо слику са Био-рада да илуструје проблем.Такође дизајнира температурни градијент за амплификацију гена са секундарном структуром.

Појављује се секундарна структура
Може се видети да како се температурни градијент смањује, производи почињу да се појављују и вредност Цт се креће напред, достижући минималну вредност на 60,7°Ц, а затим како се градијент температуре смањује, вредност Цт постаје већа.Насупрот томе, како температура расте, отвара се секундарна структура и повећава се ефикасност појачања.Након постизања одређене температуре, повећање температуре не може побољшати ефикасност појачања.Зато што се прајмери ​​у овом тренутку не могу стабилно комбиновати.дакле,потражите температуру са најнижом Цт вредношћу, што је најбоља температура за појачавање шаблона секундарне структуре!Наравно, паметне будале морају знати да ако није потребно, најбоље је променити прајмере и избећи регион секундарне структуре.
5. Ниво апликације
МИКЕ—анализа података

Анализу података углавном даје флуоресцентни квантитативни ПЦР инструмент.У претходном чланку је урађено доста посла на анализи података, као што је бланко контрола, што је објашњено у дизајну експеримента.Интерни референтни гени, бројеви понављања, итд. су разјашњени., овде углавном објашњавамо примену кПЦР.
кПЦР се широко користи, а експериментална верификација и дијагноза нуклеинске киселине су најчешће коришћени сценарији.
апсолутна квантификација
Лог (почетна концентрација) има линеарну везу са бројем циклуса.Стандардна крива се може нацртати из стандарда са познатим почетним бројем копије, односно може се добити линеарни однос реакције амплификације.Према Цт вредности узорка може се израчунати концентрација у узорку.Количина шаблона за укључивање.

Метода апсолутног квантитативног израчунавања
Апсолутна квантификација мора бити заснована на стандардној кривој.Да бисте направили стандардну криву, потребан је стандард.Обично је стандард плазмид добијен клонирањем циљног гена.Зашто је то плазмид?Зато што је кружна плазмидна ДНК најстабилнија.Стандардни производ разблажите у 5 до 6 градијента у складу са односом удвостручавања (10-струко разблаживање), и обратите пажњу на уједначеност приликом разблаживања.Нека вредност Цт падне између 15-30.

Стандардна припрема
У исто време, узорак који се испитује такође треба да се разблажи у складу са тим (запамти фактор разблажења), а вредност Цт такође треба да падне између 15-30.Стандардни производ + узорак за тестирање стављају се на машину заједно.Након рада, направљена је стандардна крива са стандардном супстанцом, а узорци за испитивање су доведени у стандардну криву да би се израчунала концентрација.
Квантификација ХБВ вируса хепатитиса Б је типична апсолутна квантификација, која може израчунати број копија вируса у 1 мл крви.
Израчунавање броја копија
Концентрација узорка за тестирање (нг/ул) = ОД260 × 50 уг/мл × фактор разблажења
Молекулска тежина узорка = број база × 324
Број копија узорка који се тестира (копије/ул) = концентрација узорка који се тестира / молекулска тежина узорка × 6 × 1014

Начин израчунавања броја копије

Наведен је начин обрачуна за одређивање количине.Ово је математички задатак који се може решити након завршетка средње школе, а математичке задатке углавном решавају рачунари.Ако не разумете, можете доћи да комуницирате.
релативна квантификација
Релативна квантификација се углавном користи у научним истраживањима.Колико вируса има у 1мл крви, а то је ДНК вирус, ово је релативно детерминистички догађај: количина крви се може одредити, а ДНК вирус је релативно стабилан.Међутим, тешко нам је да упоредимо број транскрипционих копија одређеног гена у листу, јер је тешко одредити величину, тежину и осетљивост листа, тешко је одредити количину екстраховане РНК, а тешко је одредити и ефикасност реверзне транскрипције, односно било који корак може довести до тога да експериментални подаци имају грешке и не могу се користити.
Стога, релативна квантификација мора увести елемент:интерни референтни ген.
Другим речима, релативна квантификација је заправо поређење између циљног гена и интерног референтног гена.У поређењу са истим ткивом и истој ћелији, утицај величине узорка, количине екстракције РНК, ефикасности реверзне транскрипције и ефикасности ПЦР-а је релативно мали.Због мале величине узорка, и интерни референтни гени и циљни гени су релативно смањени.Због тога смо раније наглашавали униформност и стабилност.
Унутрашњи референтни гени су генералнодомаћински гени(хоусе-кеепинг генес), који се односе на класу гена који су стабилно експримирани у свим ћелијама, а њихови производи су неопходни за одржавање основних животних активности ћелија.
Немојте збунити овај концепт.Гени за одржавање домаћинства су термини биолошке функције, док су интерни референтни гени експериментални технички термини.Гени за одржавање домаћинства морају да прођу валидацију пре него што буду изабрани као интерни референтни гени.
На пример, одабрали смо неколико гена за одржавање домаћинства на слици испод да бисмо тестирали нивое њихове експресије у различитим ћелијама ткива и открили да су нивои експресије β-2-микроглобулина прилично различити од оних за остала три гена, тако да се не могу користити као интерни референтни гени.

Након разумевања функције корекције унутрашњег референтног гена, изведена су два алгоритма услед увођења интерног референтног гена.
·метода двоструке стандардне криве
·2 – △△Цт метода (метода поређења вредности ЦТ)
Ако сте заинтересовани за проучавање врста и функција гена, молимо вас да одустанете од истраживања алгоритама и директно користите формуле или директно користите машине;ако сте стрејт момак у математици и инжењерству, слободно.
метода двоструког стандарда криве
Квантификујте циљни ген и ген за одржавање домаћинства контролног узорка и узорка који ће се тестирати кроз стандардну криву, а затим израчунајте релативну вредност према формули за израчунавање, што је релативни ниво експресије.
Предности: једноставна анализа, релативно једноставна експериментална оптимизација
Недостатак: За сваки ген, сваки круг експеримената мора направити стандардну криву
Примена: Једна од две најчешће коришћене и признате релативне квантитативне методе у проучавању регулације експресије гена
Формула је следећа:

Примери су следећи:

Израчунајте релативни износ на основу квантитативног резултата
2 – △△Цт метода (метода поређења вредности ЦТ)

Предности: Нема потребе за прављењем стандардне криве
Недостаци: Претпоставља се да је ефикасност амплификације близу 100%;стандардна девијација је < 5%, а претпоставља се да су стандардна крива и ефикасност између сваког појачања конзистентне;оптимизација експерименталних услова је компликованија.
Примена: Једна од две најчешће коришћене и признате релативне квантитативне методе у проучавању регулације експресије гена

Наравно, ефикасност амплификације обично је немогуће да буде савршена 1. Метод корекције: Ако знамо да циљни ген и референтни ген имају исту ефикасност амплификације, али ефикасност амплификације није једнака 1, онда се 2－△△Цт може исправити на следећи начин: (1+Е)－△△Цт, на пример, формула амплификације може бити тачна 0,19, онда је формула 0 до 9 тачна. 5－△△Цт
До сада је завршен садржај о флуоресцентном квантитативном ПЦР-у.